Unser Protokoll ist darauf ausgelegt, die biophysikalischen Mechanismen für den Transport von Fracht durch Teams identischer oder entgegengesetzter zytoskelettaler motorischer Proteine zu untersuchen. Durch die Verwendung von DNA-Origami für die molekulare Konstruktion kann diese Methode für die Art, Anzahl und Position von Motoren auf genau definierten Ladungsformen wählen. Während sich dieses Protokoll auf die mikrotubulierbasierten Motoren Dynein und Kinesin konzentriert, ist es anpassungsfähig an das aktinbasierte Motormyosin sowie auf andere Proteinsysteme, die kooperativ funktionieren.
Ein herausfordernder Aspekt dieses Protokolls ist die Aufrechterhaltung der Integrität und Aktivität der motorischen Proteine während des gesamten Reinigungsprozesses, da sie empfindlich auf Hitze und mechanische Kraft reagieren. Um das motorische Proteinwachstum und die Expression über Galaktose-Promotor zu induzieren, verwenden Sie einen sterilen Impfstab, um den gefrorenen Hefestamm von Interesse auf einer Hefe-Pepton-Dextrose-Kulturplatte für eine drei- bis viertägige Inkubation bei 30 Grad Celsius zu streifen. Am vierten Tag der Kultur, wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern zwischen 1,5 und zwei liegt, sammeln Sie die Hefezellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in Wasser wieder auf, um sie zu waschen und die Zellen in einer einzigen Flasche zu konsolidieren.
Drehen Sie die Zellen erneut zur Sammlung, und setzen Sie das Pellet in etwa zwei Milliliter doppelliter doppeldestilliertem Wasser wieder aus. Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zellschlämme langsam in flüssigen Stickstoff zu geben, einen Tropfen nach dem anderen, um gefrorene Hefezellpellets zu produzieren. Zur motorischen Proteinreinigung verwenden Sie eine mit flüssigem Stickstoff vorgekühlte Kaffeemühle vom Klingentyp, um die gefrorenen Hefepellets in ein feines Pulver zu mahlen, und übertragen Sie das Hefepulver in ein vorgekühltes, 100-Milliliter-Glasbecher glasbecherauf Eis.
Fügen Sie ein kleines Volumen von frisch zubereiteten 4X LysePuffer mit Ergänzungen zum Pulver, so dass die endgültige Konzentration des Puffers nicht mehr als 1X, und legen Sie das Becherglas in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad mit kontinuierlichem Rühren mit einem Spachtel, um das Pulver schnell aufzutauen. Fügen Sie zusätzlichen 4X Puffer mit Ergänzungen hinzu, um die endgültige Pufferkonzentration auf 1X im Lysat zu bringen. Das Endvolumen liegt oft zwischen 25 und 30 Millilitern.
Dann sammeln Sie die Hefezellen durch Zentrifugation und übertragen Sie das lösliche Protein, das Überstand enthält, in eine neue 50-Milliliter-Konustube auf Eis. Für die IgG-Affinitätsreinigung 200 Mikroliter gewaschene Affinitätsperlensuspension in den Proteinextrakt geben und die Mischung bei vier Grad Celsius für eine Stunde mit sanfter Rotation inkubieren. Filtern Sie die Mischung am Ende der Inkubation durch dieselbe Chromatographiesäule, mit der die Perlen bei vier Grad Celsius zubereitet werden, gefolgt von zwei Wäschen mit fünf Millilitern Waschpuffer pro Waschgang auf Eis.
Nach dem zweiten Waschen spülen Sie die Perlen auf Eis mit fünf Millilitern TEV-Puffer, so dass der Puffer vollständig aus der Säule abfließen kann. Für die DNA-Oligonukleotid-Etikettierung die Chromatographie-Säule kappen und die Motorperlen mit 100 Mikrolitern TEV-Puffer bebrüten, ergänzt um 10 bis 20 Mikromolar des gereinigten Benzylguanin-Oligos bei Raumtemperatur für 10 bis 15 Minuten, wobei die Perlen einmal pro Minute sanft wieder aufgesetzt werden. Waschen Sie die Perlen am Ende der Inkubation viermal mit frischem TEV-Puffer pro Wäsche, wie soeben gezeigt, bevor Sie den Boden des Rohres wieder anbringen, um eine Resuspension der Motorperlen in nicht mehr als 200 Mikroliter frischer TEV-Puffer zu ermöglichen.
Für TEV-Spaltung die Motorperlenaufhängung auf ein Zwei-Milliliter-, rundboden-Mikrozentrifugenrohr übertragen und die Motorperlen mit ca. 0,3 Einheiten TEV-Protease pro Mikroliter Motorperlenmischung bei 16 Grad Celsius für eine Stunde bei sanfter Rotation bebrüten. Zentrifugieren Sie am Ende der Inkubation die Motorperlen und sammeln Sie die Mischung an der Unterseite des Rohres. Als nächstes verwenden Sie eine geschnittene P1000 Pipettenspitze, um das Gemisch in eine Spin-Säule zu übertragen, und zentrifugieren Sie das Gemisch, wie gerade gezeigt.
Sammeln Sie das Filtrat, das die TEV-gesponnenen, gereinigten Motoren enthält, und aliquotieren Sie das Filtrat in 50-Mikroliter-Volumen für die Mikrotubuli-Affinitätsreinigung. Dann blitzen die Aliquots in flüssigem Stickstoff für minus 80 Grad Celsius Lagerung ein. Zur Fahrwerksreinigung am späten Nachmittag des Tages vor der Reinigung 80 Mikroliter der Konzentration von Glycerin im Origami-Faltpuffer in einem Zentrifugenrohr vorsichtig schichten.
Die Grenzen zwischen den Ebenen sollten leicht sichtbar sein. Nach einer nächtlichen Inkubation bei vier Grad Celsius 10% Glycerin im Origami-Faltpuffer in gefalteter Chassislösung über die oberste Schicht des Farbverlaufs schichten und den Farbverlauf mit dem Chassis zentrieren. Am Ende der Zentrifugation 50-Mikroliter-Fraktionen des Gradienten in einer Von-boden-Richtung sammeln und fünf Mikroliter jeder Fraktion in einzelne Brunnen eines 2%Agarose-Gels laden.
Nach 90 bis 120 Minuten bei 70 Volt, stellen Sie das Gel unter Bedingungen, die für den verwendeten DNA-Gel-Fleck geeignet sind. Quantifizierte Konzentrationen der ausgewählten Zinsfraktionen können mit den entsprechenden standardspektroskopischen Methoden bestimmt werden. Die SDS-PAGE-Analyse kann verwendet werden, um die erfolgreiche Extraktion von Dynein aus Hefe zu bestätigen, da das endgültige Filtrat ein klares, scharfes Band bei ca. 350 Kilodalton enden weist.
TEV-Protease ist auch im endletzten Filtrat enthalten und bildet bei etwa 50 Kilodaltonen ein klares Band. Nach der Mikrotubuli-Affinitätsreinigung erscheint Dynein als klares Einzelband bei 350 Kilodaltonen, während Kinesin als leicht verschmiert werden kann, mehrere Bänder bei etwa 120 Kilodaltonen. Neben der TEV-Protease kann auch eine spürbare Menge Tubulin im letzten Überstand beobachtet werden.
Die Faltung von DNA-Origami-Strukturen kann durch Agarose-Gel-Elektrophorese beobachtet werden, mit einer Verschiebung der Mobilität zwischen dem reinen, aufgeklappten Gerüststrang und der Faltreaktion, die auf Origamifaltung hinweist. Darüber hinaus weist die Faltreaktion auf eine gewisse Multimerisierung von Fahrwerksstrukturen hin. Die Beweglichkeit von Motorchassis-Ensembles ist leicht nachweisbar und messbar auf Kymographen, die aus TIRF-Filmen generiert werden, da die Kymographen flexibler Chassis, die zu sieben Dynein-Proteinen konjugiert sind, hochgradig prozessive Durchläufe bei relativ konstanten Geschwindigkeiten zeigen.
Es ist wichtig, die Temperatur der motorischen Proteine bei jedem Schritt des Verfahrens sorgfältig zu kontrollieren. Nach der Reinigung der motorischen Proteine und des DNA-Origami-Chassis können die beiden Komponenten für Motilitätstests der Ensembles unter einem TIRF-Mikroskop konjugiert werden. Diese Methode ermöglicht die Entschlüsselung der biophysikalischen und biochemischen Mechanismen, die die entstehende Beweglichkeit der Motorensembles steuern.
