当社のプロトコルは、同一または反対方向の細胞骨格運動タンパク質のチームによる貨物の輸送を支配する生物物理学的メカニズムを探査するように設計されています。分子構造にDNA折り紙を用いることで、正確に定義された貨物形状のモータの種類、数、位置を選択できます。このプロトコルは、微小管ベースのモータダイネインとキネシンに焦点を当てていますが、アクチンベースのモータミオシンだけでなく、協調的に機能する他のタンパク質システムにも適応可能です。
このプロトコルの難しい側面の1つは、加熱と機械的な力に敏感であるため、精製プロセス全体を通じてモータータンパク質の完全性と活性を維持することです。ガラクトースプロモーターを介して運動タンパク質の成長と発現を誘導するには、無菌接種杖を使用して、30°Cで3〜4日間のインキュベーションのために酵母ペプトンデキストロース培養プレートに目的の凍結酵母株をストリークします。培養4日目、600ナノメートルの光学密度が1.5~2の間の場合、遠心分離により酵母細胞を採取し、ペレットを水に再懸濁して洗浄し、細胞を1本に統合する。
細胞を再び回転させて回収し、ペレットを約2ミリリットルの二重蒸留水で再懸濁します。その後、10ミリリットルのピペットを使用して、細胞スラリーを一滴ずつ液体窒素にゆっくりと分配し、凍結酵母細胞ペレットを生成します。モータータンパク質精製のために、冷凍酵母ペレットを細かい粉末に粉砕するために、液体窒素であらかじめ冷やされたブレードタイプのコーヒーグラインダーを使用し、酵母粉末を氷の上の冷蔵100ミリリットルのガラスビーカーに移します。
バッファーの最終的な濃度が1Xを超えないように、粉末にサプリメントで作りたての4X溶解バッファーの少量を追加し、迅速に粉末を解凍するためにスパチュラで連続攪拌して37°Cの水浴にビーカーを置きます。サプリメントを追加 4X バッファーを追加して、最終的なバッファー濃度を 1X にリセートします。最終容積は、多くの場合、25と30ミリリットルの間です。
次いで遠心分離により酵母細胞を採取し、上清を含む可溶性タンパク質を氷上の新しい50ミリリットル円錐形チューブに移す。IgGアフィニティー精製の場合、200マイクロリットルの洗浄されたアフィニティービーズ懸濁液をタンパク質抽出物に加え、穏やかな回転で1時間摂氏4度でインキュベートします。インキュベーションの終わりに、ビーズを摂氏4度で調製するために使用したのと同じクロマトグラフィーカラムを通して混合物をフィルタリングし、続いて氷上で洗浄1回あたり5ミリリットルの洗浄バッファーを2回洗浄します。
2回目の洗浄後、ビーズを5ミリリットルのTEVバッファーで氷上で洗い流し、バッファーをカラムから完全に排出できるようにします。DNAオリゴヌクレオチド標識の場合、クロマトグラフィーカラムをキャップし、精製ベンジルグアニンオリゴの10〜20マイクロモルを室温で10〜20マイクロモルで補ったTEVバッファー100マイクロリットルでモータビーズを10〜15分間インキュベートし、1分間に1回静かに再懸濁する。インキュベーションの最後に、新鮮なTEVバッファーの200マイクロリットル以下でモータービーズの再懸濁を可能にするためにチューブの底を再調整する前に、ちょうど実証したように、洗浄ごとに新鮮なTEVバッファーでビーズを4回洗浄します。
TEV切断の場合、モータービーズの懸濁液を2ミリリットル、ラウンドボトム、マイクロ遠心分離チューブに移し、1マイクロリットルのTEVプロテアーゼを1マイクロリットルあたり約0.3単位のTEVプロテアーゼで16°Cで穏やかな回転で1時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、モータービーズを遠心分離し、チューブの底部に混合物を集める。次に、カットP1000ピペットチップを使用して混合物をスピンカラムに移し、ちょうど実証したように混合物を遠心分離する。
微小管親和性精製のために、TEV切断、精製モータ、および濾液を50マイクロリットルの体積でアリコートして含む濾液を収集します。その後、フラッシュはマイナス80°Cの貯蔵のために液体窒素中のアリコートを凍結します。シャシー精製のために、精製前日の午後遅くに、遠心管内の折り紙折りたたみバッファー中のグリセロールの濃度をそれぞれ80マイクロリットルにそっと層化する。
レイヤー間の境界が少し表示されます。摂氏4度で一晩インキュベーションした後、折り畳まれたシャシー溶液の折り畳み式の折り畳みバッファに10%グリセロールを層し、シャーシで勾配を遠心分離します。遠心分離の終わりに、上から下の方向に勾配の50マイクロリットル分を収集し、2%アガロースゲルの個々のウェルに各画分の5マイクロリットルをロードします。
70ボルトで90〜120分後、使用するDNAゲル染色に適した条件を用いてゲルを画像化する。選択した対象画分の定量濃度は、適切な標準分光法を用いて決定することができる。SDS-PAGE分析は、最終的な濾液が約350キロダルトンで明確で鋭いバンドを示すように、酵母からのダイニンの抽出に成功したことを確認するために使用することができます。
TEVプロテアーゼは、最終濾液中にも存在し、約50キロダルトンで透明なバンドを形成する。微小管アフィニティー精製後、ダイネインは350キロダルトンで明確な単一バンドとして現れ、キネシンはわずかにスミアとして観察され、約120キロダルトンで複数のバンドが観察される。TEVプロテアーゼに加えて、最終的な上清においても顕著な量のチューブリンが観察される。
DNA折り紙構造の折り畳みはアガロースゲル電気泳動によってアッセイすることができ、純粋に展開された足場と折り紙折りたたみを示す折りたたみ反応との間の移動性の変化を伴う。さらに、折りたたみ反応は、シャーシ構造の多量体化の存在を示しています。7つのダイニンタンパク質に結合された柔軟なシャシーのキモグラフは、比較的一貫した速度で非常にプロセス的な実行を示すため、モーターシャーシアンサンブルの運動性は、TIRFムービーから生成されたキモグラフ上で容易に検出可能で測定可能です。
手順の各ステップでモータタンパク質の温度を注意深く制御することが重要です。モータータンパク質とDNA折り紙シャーシの精製に続いて、2つの成分をTIRF顕微鏡下でアンサンブルの運動性アッセイに結合させることができます。この方法は、モーターアンサンブルの出現運動性を制御する生物物理学的および生化学的メカニズムを解読することを可能にする。
