הפרוטוקול שלנו נועד לחקור את המנגנונים הביופיזיים המסדירים הובלת מטען על ידי צוותים של חלבונים מוטוריים ציטוסקלטליים זהים או מכוונים הפוך. באמצעות אוריגמי DNA לבנייה מולקולרית, שיטה זו יכולה לבחור עבור סוג, מספר, ומיקום של מנועים על צורות מטען מוגדרות במדויק. בעוד פרוטוקול זה מתמקד מנועים מבוססי microtubule dynein ו kinesin, הוא הסתגלות מיוסין מנוע מבוסס actin, כמו גם למערכות חלבון אחרות לתפקד בשיתוף פעולה.
היבט מאתגר אחד של פרוטוקול זה הוא לשמור על השלמות והפעילות של החלבונים המוטוריים לאורך כל תהליך הטיהור, מכיוון שהם רגישים לחום ולכוח מכני. כדי לגרום לצמיחה וביטוי של חלבונים מוטוריים באמצעות מקדם גלקטוז, השתמש בשרביט חיסון סטרילי כדי לפס את זן השמרים הקפואים של עניין על צלחת תרבות שמרים-peptone-dextrose עבור דגירה של שלושה עד ארבעה ימים ב 30 מעלות צלזיוס. ביום הרביעי לתרבות, כאשר הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר הוא בין 1.5 לשניים, לאסוף את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה, ולתלות מחדש את גלולה במים כדי לשטוף אותם ולאחד את התאים בבקבוק אחד.
לסובב את התאים שוב לאיסוף, ולתלות מחדש את גלולה בערך שני מיליליטר של מים מזוקקים כפולים. לאחר מכן השתמש פיפיטה 10 מיליליטר לאט לחלק את תרחיף התא לתוך חנקן נוזלי טיפה אחת בכל פעם כדי לייצר כדורי תא שמרים קפואים. לטיהור חלבונים מוטוריים, השתמשו במטחנת קפה מסוג להב מקוררת מראש עם חנקן נוזלי כדי לטחון את כדורי השמרים הקפואים לאבקה דקה, ולהעביר את אבקת השמרים לתוך זכוכית מצוננת מראש, 100 מיליליטר, על הקרח.
מוסיפים נפח קטן של חיץ תות 4X שהוכן טרי עם תוספי תזונה לאבקה, כך הריכוז הסופי של החיץ לא יעלה על 1X, וממקמים את הקוף באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב מתמשך עם מרית כדי להפשיר במהירות את האבקה. הוסף מאגר 4X נוסף עם תוספי מזון כדי להביא את ריכוז המאגר הסופי 1X בליזט. הכרך הסופי הוא לעתים קרובות בין 25 ל 30 מיליליטר.
לאחר מכן לאסוף את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה, ולהעביר את החלבון המסיס המכיל על טבעי לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר על קרח. לטיהור זיקה IgG, מוסיפים 200 מיקרוליטר של מתלי גם זיקה שטופים לתמצית החלבון, ומדוגים את התערובת בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עם סיבוב עדין. בסוף הדגירה, לסנן את התערובת דרך אותו עמוד כרומטוגרפיה המשמש להכנת חרוזים בארבע מעלות צלזיוס, ואחריו שתי שטיפות עם חמישה מיליליטר של חיץ לשטוף לכל לשטוף על קרח.
לאחר הכביסה השנייה, לשטוף את חרוזים על קרח עם חמישה מיליליטר של חיץ TEV, המאפשר את המאגר לנקז באופן מלא מן העמוד. עבור תיוג אוליגונוקלאוטיד DNA, כובע את עמוד הכרומטוגרפיה, ולהדגיר את קדילי המנוע עם 100 microliters של חיץ TEV בתוספת 10 עד 20 micromolar של אוליגו בנזילגואנין מטוהרים בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות, בעדינות resuspending את חרוזים פעם בדקה. בסוף הדגירה, לשטוף את חרוזים ארבע פעמים עם חיץ TEV טרי לכל לשטוף כפי שהודגם רק, לפני סכם את החלק התחתון של הצינור כדי לאפשר הפוגה של בחנורי המנוע לא יותר מ 200 microliters של חיץ TEV טרי.
עבור מחשוף TEV, להעביר את המתלה חרוז המנוע לשני מיליליטר, עגול למטה, צינור microcentrifuge, ולהדקר את בחנורי המנוע עם כ 0.3 יחידות של פרוטאז TEV לכל microliter של תערובת חרוזים מנוע ב 16 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם סיבוב עדין. בסוף הדגירה, צנטריפוגה בחנורי המנוע, ולאסוף את התערובת בתחתית הצינור. לאחר מכן, השתמשו בקצה פיפטה P1000 חתוך כדי להעביר את התערובת לעמודת ספין, וצנטריפוגה של התערובת כפי שהוכח זה בלבד.
אסוף את הסינון המכיל את המנועים המטוהרים והמטוהרים של TEV, ועלה על הסינון בנפחים של 50 מיקרוליטר לטיהור זיקה למיקרוטובולים. ואז פלאש להקפיא את aliquots בחנקן נוזלי עבור אחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס. לטיהור השלדה, בשעות אחר הצהריים המאוחרות של היום שלפני הטיהור, שכבה בעדינות 80 microliters כל ריכוז של גליצרול במאגר קיפול אוריגמי בצינור צנטריפוגה.
הגבולות בין השכבות צריכים להיות גלויים מעט. לאחר דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס, שכבה 10%גליצרול במאגר קיפול אוריגמי בתמיסת שלדה מקופלת מעל השכבה העליונה של השיפוע, וצנטריפוגה של השיפוע עם המארז. בסוף הצנטריפוגה, לאסוף שברים 50 מיקרוליטר של שיפוע בכיוון מלמעלה למטה, ולהעמיס חמישה microliters של כל שבר לתוך בארות בודדות של 2%agarose ג'ל.
לאחר 90 עד 120 דקות ב 70 וולט, תמונה הג'ל באמצעות תנאים המתאימים לכתם ג'ל DNA בשימוש. ריכוזים מכומתים של שברי העניין שנבחרו ניתן לקבוע באמצעות השיטות הספקטרוסקופיות הסטנדרטיות המתאימות. ניתוח SDS-PAGE יכול לשמש כדי לאשר את החילוץ המוצלח של dynein מן השמרים, כמו הסינון הסופי מראה רצועה ברורה, חדה בערך 350 קילודלטון.
פרוטאז TEV קיים גם בסינון הסופי ויוצר רצועה ברורה בכ -50 קילודלטונים. לאחר טיהור זיקה microtubule, dynein מופיע ברור, להקה אחת ב 350 קילודלטון, בעוד kinesin ניתן לראות כמו מעט מריחה, להקות מרובות על 120 קילודלטונים. בנוסף פרוטאז TEV, כמות ניכרת של tubulin ניתן לראות גם על טבעי הסופי.
קיפול של מבנים אוריגמי DNA ניתן לראות על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose, עם שינוי בניידות בין גדיל הפיגום התגלגל טהור התגובה המתקפלת המציין קיפול אוריגמי. בנוסף, התגובה המתקפלת מציינת את נוכחותם של מספר רב-תכליתי של מבני מארז. תנועתיות הרכבי השלדה המוטורית ניתנת לזיהוי ומדידה בקלות בקימוגרפים הנוצרים מסרטי TIRF, גם כאשר הקימוגרף של שלדה גמישה המורכב לשבעה חלבוני dynein מדגים ריצות מעבדתיות מאוד במהירות עקבית יחסית.
זה חיוני כדי לשלוט בזהירות את הטמפרטורה של חלבונים מוטוריים בכל שלב של ההליך. לאחר טיהור החלבונים המוטוריים ומארז אוריגמי DNA, שני המרכיבים יכולים להיות נדוש עבור בדיקות תנועתיות של ההרכבים תחת מיקרוסקופ TIRF. שיטה זו מאפשרת לפענח את המנגנונים הביופיזיים והביוכימיים השולטים במניע המתהוה של ההרכבים המוטוריים.
