وقد استخدم هذا البروتوكول لأكثر من 40 عاما، ويبقى الطريقة الوحيدة الموثوقة لزرع الخلايا الثديية في الفئران. وتستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع لاستجواب الخلايا الثديية المستقلة مقابل آثار المضيف في أبحاث قابلية سرطان الثدي. عن طريق التطعيم في وسادة الدهون بين الكتفين، هذه الطريقة يتحايل على الحاجة إلى مسح ظهارة الغشاء الداخلي الذي ليس فعالا في الفئران.
ولذلك فإن الأسلوب هو أقل الغازية والغدد الثديية الذاتية يمكن استخدامها كضوابط داخلية. لبدء هذا الإجراء، وضع فأر أنثى القتل الرحيم على ظهره وتأمينه مع دبابيس. رش كامل سطح البطن مع 70٪ الإيثانول.
جعل شق على شكل Y القوس السماح بالوصول إلى الغدد الثديية الصدرية والبطنية والأربية. استخدم المقص لتشريح جميع أنسجة الغدة الثديية من الجرذ المتبرع وإزالة جميع الغدد الليمفاوية المرئية. بعد ذلك، استخدم ملقط لاستخراج الأنسجة الثديية.
وضعه في طبق 60 ملليمتر المسمى التي تحتوي على 500 ميكرولترات من المصل خالية DMEM F12 وسائل الإعلام والاحتفاظ بها على الجليد. ثم استخدام مقص ل mince ناعما الأنسجة الثديية. أولاً، قم بتدّيّد جسم الحيوان المانح لوضعه في وضعٍ مُرَرّيّ وآمنه بدبابيس.
رش الرأس وأعلى الظهر مع 70٪ الإيثانول. حدد موقع قاعدة الجمجمة وشق تحت المتدلي، إدراج مقص حاد تحت الجلد وقطع الجلد بعيدا عن الجمجمة بما في ذلك الجانبين من الرأس. بعد ذلك، استخدم قواطع العظام أو مقص قوي لقطع الجمجمة على طول خط الوسط من القذال إلى عظام أمامية مع التأكد من الحفاظ على النصل سطحي قدر الإمكان وزاوية أعلى لمنع تدمير أنسجة الدماغ الأساسية.
استخدام Rongeurs أو ملقط قوية لقشر بعيدا العظام. أدخل الأداة الجانبية إلى المخيخ لكسر العظام على كلا الجانبين. قطع الاتصالات إلى السحايا عن طريق فضح القناة السمعية بشكل كامل.
استخدم ملقطًا منحنية ذات رؤوس دقيقة لرفع الدماغ من الجمجمة وتسجيل وزنه. استخدام بداية جديدة من الإمدادات لأدمغة المانحين إضافية. قم بنقله على الفور إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على كمية متساوية من الوسائط المخزنة على الجليد.
التجانس الدماغ لمدة 10 إلى 15 ثانية على سرعة منخفضة. ثم تصفية المتجانسة لإزالة قطع كبيرة. تخزين السائل على الجليد حتى الحاجة.
أولا، قطع سنتيمتر واحد قبالة نهاية 1،000 ميكرولتر ماصات تلميح ووضعها يدويا على pipettor. استخدام تلميح ماصة قطع لنقل الأنسجة المانحة المفروم من كل طبق 60 ملليمتر إلى أنبوب الهضم collagenase. خلط بلطف الأنسجة المفروم عن طريق الأنابيب عنه صعودا وهبوطا مرة واحدة إلى مرتين.
ثم تأمين العينات في وضع أفقي في حاضنة الاهتزاز. السماح للعينات لهضم لمدة 1.5 إلى ساعتين في 37 درجة مئوية في حين تهتز بسرعة بين 200 و 220 دورة في الدقيقة. عندما يتم هضم أنسجة الغدة الثديية المانحة بالكامل ، يتم هضم جهاز الطرد المركزي في التعليق 1 ، 200 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
بعد التأكد من قد شكلت بيليه، واستخدام ماصة لإزالة طبقة الدهون أو صب بعناية قبالة ناظر. إعادة تثبيت بلطف بيليه في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام DMEM F12 الطازجة. كرر هذه العملية لغسل الخلايا جيدا.
إعداد أنبوب واحد 50 ملليلتر مع مصفاة 40 ميكرومتر لكل المانحة. قبل الرطب مصفاة مع ملليلتر واحد على الأقل من وسائل الإعلام DMEM F12. ثم استخدام ماصة لتمرير تعليق الخلية من خلال مرشح لجمع شظايا القناة أو organoids.
بالنسبة للعضيات، احتفظ فقط بالخلايا التي تبقى في عامل التصفية. عكس مصفاة الخلية على أنبوب جديد 50 ملليلتر وشطف مع أي حجم من وسائل الإعلام العقيمة المطلوبة لجمع كل الخلايا. بعد هذا, بيليه الخلايا مرة أخرى و resuspend في حجم صغير من وسائل الإعلام للعد.
إعداد دفعات واحدة من المواد المانحة لجميع متلقي زرع من خلال الجمع بين وحدات التخزين متساوية من تعليق الخلية مع 50٪ تجانس الدماغ لكل موقع من مواقع زرع. أولاً، تحديد قاعدة الجمجمة وبداية العمود الفقري على المتلقي. تقريبا ثلث الطريق أسفل العمود الفقري، يحلق ثلاثة سنتيمتر في اثنين من منطقة سنتيمتر على الجزء الصدري العلوي من الظهر.
بعد ذلك، قم بإعداد الحقل العقيم الذي سيتم استخدامه للجراحة وترتيب جميع الإمدادات اللازمة. قم بشطف المحاقن هاملتون مع وسائل الإعلام DMEM F12 العقيمة لمنع فقدان الخلايا. قم بتحميل كامل حجم المواد المانحة في حقنة منفصلة لكل حالة.
بعد حقنة هو محملة بالكامل، عكس ذلك واضغط على المكبس قليلا لإزالة فقاعات الهواء في طرف الإبرة. إبقاء الحقنة على الجليد طوال العملية. تأكد من أن الحيوان لا يستجيب للمحفزات العميقة مع قرصة إصبع إصبع قوية.
ثم استخدم شفرة جراحية حادة لعمل شق صغير بين الكتفين. تحديد موقع الأوعية الدموية الوسيطة للتوجه واستخدام ملقط لرفع الجلد على جانب واحد من شق. أمسك الجلد بعيدًا عن وسادة الدهون وتجنب الدهون البنية الأساسية أثناء إجراء عملية الزرع.
بعد ذلك، أدخل الإبرة في موقع الكسب غير المشروع. حقن بعناية 40 ميكرولترات من خليط الخلية في الأنسجة البيضاء وسادة الدهون البيضاء بين. إزالة الإبرة ببطء.
ضع الأنسجة في مكانها وتسمح للخلايا المزروعة بالاستقرار لمدة ثلاث إلى خمس ثوانٍ. كرر إجراء الحقن بأكمله كما سبق وصفه في الموقع الثاني للزرع. بعد ذلك، أغلق الجرح الجراحي باستخدام مقاطع الجرح أو الغرز ثم توقف عن التخدير.
بعد التضحية بالحيوان، أعدّه للتشريح. تحديد الأوعية الدموية الوسيطة التي تفصل مواقع الكسب غير المشروع في وسادة الدهون بين الكتفين. اجز الوسادة بأكملها كقطعة واحدة من الأنسجة.
ضع الأنسجة على شريحة مجهرية مشحونة بشكل إيجابي لل جبل كامل. ضع الشرائح في 70٪ الإيثانول لمدة سبعة إلى 10 أيام لتكريم الدهون في الأنسجة. ثم إعداد وصمة عار الشب carmine ومعالجة الشرائح عندما الأنسجة غير شفافة بما فيه الكفاية.
عند اكتمال المعالجة ومسح الأنسجة الموجودة على الشريحة ، استخدم المجهر الضوئي المنخفض أو التصوير الرقمي عالي الدقة للحصول على صور الشرائح للتحليل. في هذه الدراسة، يتم زرع الخلايا الظهارية الثديية باستخدام تقنية الأمثل للعمل مع الفئران حيث يتم تطعيم organoids الظهارية الثديية المعزولة من الفئران المانحة في وسادة الدهون البيضاء بين الكتفين من الفئران المتلقية. يمكن تقييم وجود أو غياب أو وفرة ظهارة لتحديد نجاح التجربة وكذلك استقلالية الآثار المتعلقة بالمتغيرات التجريبية.
إن تجربة زرع متبادلة حيث لكل عامل مستويين مثل النوع البري مقابل الضربة القاضية سوف تخلق أربع مجموعات زرع لاختبار الفرضية. ممثل كله شنت وسادة الدهون بين الكتفين هو مبين هنا يحتوي على الظهارية الإيجابية outgrowth في كلا الموقعين من زرع. عند تحليل الشرائح، وعدم وجود ظهارة في لوحة الدهون بين الكتفين عبر العديد من العينات قد تشير إلى وجود مشكلة فنية مع الإجراء وينبغي أن تعامل على أنها نتيجة سلبية.
ويمكن أيضاً مقارنة النمو الظهاري للمتبرع بالغدة الثديية الذاتية، وقد يسهل التوصل إلى استنتاجات إضافية. في المثال المبين هنا، فإن نتائج الزرع المتبادل باستخدام النوع البري وCDKN1B الفئران بالضربة القاضية اقترحت تأثيرات مستقلة غير الثديية الخلية على تطوير الغدة الثديية. تذكر يجب أن تكون مستعدة بعناية الخلايا الظهارية المانحة وعضويات وأبقى على قيد الحياة حتى حقنها في الحيوان المتلقي.
ومن الضروري التخطيط مسبقاً وتنفيذ الإجراء بعناية ودون أي انقطاع. يمكن إجراء فحوصات التسرطن الأولية بعد الزرع لاستجواب استقلالية الخلايا الثديية في مسببات أو علاج سرطان الثدي. كما يمكن دمج تحرير الجينات لهندسة جينية للخلايا المانحة أو الفئران المتلقية.
كما الطريقة الوحيدة لأداء زرع الخلايا الظهارية ماماري في الفئران، وهذا الإجراء يسهل نمو الغدة الثديية، فضلا عن دراسات التسرطن. هذه التقنية مهم بشكل خاص للبحث عن التفاعلات بين خلايا سرطان الثدي و / أو الخلايا الظهارية الثديية مع البيئة الصغيرة المضيفة. وهو يتيح إجراء دراسات في تطوير الغدة الثديية وكذلك أبحاث سرطان الثدي.
أولئك الذين يحاولون هذه التقنية للمرة الأولى يجب تحسين الاستعدادات الخلية المانحة لضمان أقصى إنتاجية الخلية وقابليتها للحياة، ثم إجراء تجارب تجريبية صغيرة لممارسة العمليات الجراحية وتحديد أرقام الخلايا لحقن وأيضا تحديد أوقات الحضانة بعد الجراحة اللازمة للتجارب.
