Этот протокол используется уже более 40 лет и остается единственным надежным методом трансплантации клеток молочной железы, который проводится у крыс. Этот метод широко используется для допроса молочных клеток автономных по сравнению с принимающей эффекты в исследовании восприимчивости рака молочной железы. Путем прививать в interscapular жировой площадке, этот метод обходит для того чтобы очистить эндогенный эпителий мембраны который не эффективен в крысах.
Таким образом, метод является менее инвазивным и эндогенных молочных желез могут быть использованы в качестве внутреннего контроля. Чтобы начать эту процедуру, поместите усыпанную самку крысы на спину и закрелите ее булавками. Спрей всей брюшной поверхности с 70%этанола.
Сделайте сагиттаальный Y-образный разрез, позволяющий получить доступ к грудным, брюшным и паховисто-молочным железам. Используйте ножницы, чтобы вскрыть все ткани молочной железы от донорской крысы и удалить все видимые лимфатические узлы. Затем используйте типсы для извлечения молочной ткани.
Поместите его в помеченную 60-миллиметровую тарелку, содержащую 500 микролитров без сыворотки DMEM F12, и держите ее на льду. Затем используйте ножницы, чтобы мелко фарш молочной ткани. Во-первых, осторожно переверни тело животного-донора, чтобы поместить его в положение склонного и обезопасить его булавками.
Спрей головы и верхней части спины с 70%этанола. Найдите основание черепа и сделайте разрез под затылочной кондилями, вставьте острые ножницы под кожу и отрежьте кожу от черепа, включая стороны головы. Далее, используйте резцы костей или сильные ножницы, чтобы сократить череп вдоль средней линии от затылочной до лобной кости, убедившись, что держать лезвие как можно более поверхностным и под углом вверх, чтобы предотвратить разрушение основной ткани мозга.
Используйте Rongeurs или сильные миппы, чтобы очистить от кости. Вставьте инструмент боковой мозжечка, чтобы сломать кость с обеих сторон. Разорвать связи с meninges, полностью подвергая слуховой канал.
Используйте изогнутые тонко наклонные типсы, чтобы поднять мозг из черепа и записать его вес. Используйте новый старт поставок для дополнительных донорских мозгов. Немедленно перенесите его в 15-миллилитровую трубку, содержащую равное количество мультимедиа, которое хранится на льду.
Гомогенизировать мозг в течение 10 до 15 секунд на низкой скорости. Затем отфильтруть гомогенат, чтобы удалить большие куски. Храните жидкость на льду до необходимости.
Во-первых, вырезать один сантиметр от конца 1000 микролитров пипетки кончик и вручную поместить его на трубоуправление. Используйте наконечник пипетки для переноса рубленой донорской ткани из каждого 60-миллиметрового блюда в трубку для пищеварения коллагеназы. Аккуратно смешайте фарш ткани, трубя его вверх и вниз один-два раза.
Затем закрепляйте образцы в горизонтальном положении в трясущимся инкубаторе. Разрешить образцы переваривать в течение 1,5 до двух часов при 37 градусов по Цельсию при встряхивании со скоростью от 200 до 220 об/мин. Когда донорская ткань молочной железы полностью переваривается, центрифуза суспензии при 1200 раз g и при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.
После обеспечения гранулы сформировалась, используйте пипетку, чтобы удалить жировой слой или тщательно слить супернатант. Аккуратно перерасходовать гранулы в 10 миллилитров свежих DMEM F12 средств массовой информации. Повторите этот процесс, чтобы тщательно промыть клетки.
Приготовьте одну 50-миллилитровую трубку с 40-метровым ситечком для каждого животного-донора. Предварительно мокрый ситечко с по крайней мере один миллилитр DMEM F12 средств массовой информации. Затем используйте пипетку, чтобы пройти клеточной подвески через фильтр для сбора фрагментов протока или органоидов.
Для органоидов, держать только клетки, которые остаются в фильтре. Переверните клеточный ситечко над новой 50-миллилитровой трубкой и смойте любым объемом стерильных средств массовой информации, необходимых для сбора всех клеток. После этого, гранулы клетки еще раз и повторно в небольшом объеме средств массовой информации для подсчета.
Подготовьте одиночные партии донорского материала для всех реципиентов трансплантации, объединив равные объемы клеточной суспензии с 50%-ным гомогенатом мозга для каждого места трансплантации. Во-первых, определить основание черепа и начало позвоночного столба на животном-реципиенте. Приблизительно одна треть пути вниз по позвоночнику, брить три сантиметра на два сантиметра области на верхней грудной части спины.
Далее подготовьте стерильное поле, которое будет использовано для операции, и организуйте все необходимые принадлежности. Промыть шприцы Гамильтон со стерильными DMEM F12 средств массовой информации, чтобы предотвратить потерю клеток. Загрузите весь объем донорского материала в отдельный шприц для каждого условия.
После того, как шприц полностью загружен, инвертировать его и нажмите поршень немного, чтобы удалить пузырьки воздуха на кончике иглы. Держите шприц на льду на протяжении всей процедуры. Убедитесь, что животное остается не реагируя на глубокие раздражители с твердой щепоткой ноча.
Затем используйте острый хирургический лезвие, чтобы сделать небольшой межкапулярный разрез. Найдите медиальный кровеносный сосуд для ориентации и используйте типсы, чтобы поднять кожу на одной стороне разреза. Держите кожу подальше от жировой прокладки и избежать основного коричневого жира во время трансплантации выполняется.
Затем вставьте иглу в участок трансплантата. Аккуратно введите 40 микролитров клеточной смеси в межкапулярную ткань белой жировой прокладки. Снимите иглу медленно.
Держите ткань на месте и позвольте пересаженной клетки поселиться в течение трех-пяти секунд. Повторите всю процедуру инъекции, как описано ранее на втором месте трансплантации. После этого закройте хирургическую рану с помощью зажимов для ран или швов, а затем прекратите анестезию.
Пожертвовав животным, приготовьте его к вскрытию. Определите медиальный кровеносный сосуд, который отделяет участки трансплантата в межкапулярной жировой прокладке. Акциз всей площадки, как один кусок ткани.
Поместите ткань на положительно заряженный слайд микроскопа для всего крепления. Поместите слайды в 70% этанола в течение семи до 10 дней, чтобы обезжирить ткани. Затем подготовить квасцов кармин пятно и обрабатывать слайды, когда ткань достаточно непрозрачной.
Когда обработка завершена и ткань на слайде очищается, используйте малой мощности световой микроскопии или высокого разрешения цифровой фотографии для получения изображений слайдов для анализа. В этом исследовании, млекопитающих эпителиальных клеток пересаживают с помощью техники, оптимизированной для работы с крысами, где изолированные млекопитающих эпителиальных органоидов от крыс-доноров привиты в межкапулярной белой жировой площадке реципиента крыс. Наличие, отсутствие или обилие эпителия можно оценить, чтобы определить успех эксперимента, а также автономность эффектов, связанных с экспериментальными переменными.
Взаимный эксперимент трансплантации, где каждый фактор имеет два уровня, таких как дикий тип против нокаута создаст четыре группы трансплантации для тестирования гипотез. Репрезентативная вся установленная межкапулярная жировая прокладка, показанная здесь, содержит положительный эпителиальный нарой на обоих участках трансплантации. При анализе слайдов, отсутствие эпителия в межкапулярной жировой площадке во многих образцах может указывать на техническую проблему с процедурой и следует рассматривать как отрицательный результат.
Донор эпителиальный результат также можно сравнить с эндогенной молочной железы и может способствовать дополнительным выводам. В приведенном здесь примере результаты взаимной трансплантации с использованием диких крыс и крыс, выбыхах из CDKN1B, свидетельствуют о не млекопитающих клеточных автономных последствиях для развития молочной железы. Помните донорских эпителиальных клеток и органоидов должны быть подготовлены тщательно и сохранить в живых до введения в реципиент животных.
Крайне важно планировать заранее и выполнять процедуру тщательно и без каких-либо перерывов. Первичный анализ канцерогенеза может быть выполнен после трансплантации для допроса автономии молочных клеток в этиологии или лечения рака молочной железы. Редактирование генов также может быть включено в генетически инженер донорских клеток или реципиент крысы.
Как единственный метод выполнения трансплантации эпителиальных клеток молочной железы у крыс, эта процедура облегчает развитие молочной железы, а также исследования канцерогенеза. Этот метод особенно важен для исследования взаимодействий между раковыми клетками молочной железы и/или молочными эпителиальными клетками с микроокнироникой хозяина. Это позволяет исследования в развитии молочной железы, а также исследования рака молочной железы.
Те, кто пытается этот метод в первый раз должны оптимизировать донорских клеток препаратов для обеспечения максимальной урожайности клеток и жизнеспособности, а затем выполнить небольшие экспериментальные эксперименты на практике хирургических процедур и определить количество клеток для инъекций, а также определить послеоперационные инкубации раз, необходимых для экспериментов.
