이 프로토콜은 40 년 이상 사용되어 왔으며 쥐의 유방 세포 이식 분석법을위한 유일한 신뢰할 수있는 방법입니다. 이 방법은 유방암 감수성 연구에서 숙주 효과 대 유방 세포 자율을 심문하는 데 널리 사용됩니다. 대용량 지방 패드에 이식함으로써,이 방법은 쥐에 효과적이지 않은 내인성 막 상피를 지울 필요가 우회.
따라서 방법은 덜 침습적이며 내인성 유방 땀샘은 내부 제어로 사용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 안락사 된 여성 쥐를 등에 놓고 핀으로 고정하십시오. 70%에탄올로 전체 복부 표면을 스프레이합니다.
흉부, 복부 및 잉게인 유방 땀샘에 접근할 수 있는 처진 Y자형 절개를 만듭니다. 가위를 사용하여 기증자 쥐의 모든 유방 선 조직을 해부하고 모든 눈에 보이는 림프절을 제거하십시오. 다음으로, 매머 조직을 추출하기 위해 집게를 사용합니다.
세럼이 없는 DMEM F12 미디어 500마이크로리터가 포함된 60mm 크기의 접시에 담아 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 가위를 사용하여 유방 조직을 잘게 다진다. 첫째, 조심스럽게 기증자 동물의 몸을 뒤집어 경향이있는 위치에 놓고 핀으로 고정하십시오.
머리와 위쪽 을 70%에탄올로 스프레이합니다. 두개골의 기초를 찾아 목막 응다 아래 절개를하고, 피부 아래에 날카로운 가위를 삽입하고 머리의 측면을 포함하여 두개골에서 피부를 잘라. 다음으로, 뼈 커터 또는 강한 가위를 사용하여 후두에서 전두엽 뼈까지 중간선을 따라 두개골을 자르고 블레이드를 가능한 한 피상적으로 유지하고 기본 뇌 조직의 파괴를 방지하기 위해 위쪽으로 기울어져 있는지 확인하십시오.
Rongeurs 또는 강한 집게를 사용하여 뼈를 벗겨냅니다. 도구를 소뇌에 측면 삽입하여 양쪽의 뼈를 부러뜨린다. 청각 운하를 완전히 노출하여 수뇌에 대한 연결을 끊습니다.
곡선미세 한 집게를 사용하여 두개골에서 뇌를 들어 올리고 무게를 기록하십시오. 추가 기증자 두뇌를 위한 공급의 새로운 시작을 사용하십시오. 얼음에 저장된 동일한 양의 미디어를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 즉시 전송합니다.
저속으로 10~15초 동안 뇌를 균질화합니다. 그런 다음 동형모를 필터링하여 큰 조각을 제거합니다. 필요할 때까지 얼음 위에 액체를 보관하십시오.
먼저 1, 000 마이크로리터 파이펫 팁끝에서 1센티미터를 자르고 수동으로 파이펫에 놓습니다. 각 60mm 접시에서 콜라게나아제 소화 튜브로 다진 기증자 조직을 전송하기 위해 절단 파이펫 팁을 사용합니다. 다진 조직을 1~2회 위아래로 배관하여 부드럽게 섞는다.
그런 다음 흔들리는 인큐베이터에서 수평 위치에 샘플을 고정합니다. 200~220RPM 의 속도로 흔들리는 동안 시료를 섭씨 37도에서 1.5~2시간 동안 소화할 수 있습니다. 기증자 유방 선조직이 완전히 소화되면 서스펜션을 1, 200 배, 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심 분리하십시오.
펠릿이 형성되었는지 확인 한 후 파이펫을 사용하여 지방 층을 제거하거나 조심스럽게 상체를 부어 넣습니다. 신선한 DMEM F12 미디어의 10 밀리리터에서 펠릿을 부드럽게 재중단합니다. 이 과정을 반복하여 세포를 철저히 세척하십시오.
모든 기증자 동물을 위한 40 마이크로미터 여과기를 갖춘 50 밀리리터 튜브 를 준비하십시오. DMEM F12 미디어의 적어도 1 밀리리터로 스트레이너를 미리 적시하십시오. 그런 다음 파이펫을 사용하여 필터를 통해 세포 현탁액을 전달하여 덕트 단편 이나 오르가노이드를 수집합니다.
오르가노이드의 경우 필터에 남아 있는 세포만 유지합니다. 새로운 50 밀리리터 튜브를 통해 세포 여과기를 반전하고 모든 세포를 수집하는 데 필요한 멸균 매체의 모든 볼륨으로 헹구십시오. 그 후, 세포를 다시 한 번 펠릿하고 계산을 위한 소량의 미디어에서 다시 중단합니다.
이식의 모든 부위에 대해 50%의 뇌 동종과 세포 현탁액의 동일한 양을 결합하여 모든 이식 수령인을 위한 단일 공여자 물질을 준비한다. 첫째, 두개골의 기초를 식별하고 받는 동물에 척추 컬럼의 시작을 확인합니다. 척추를 내려가는 길의 약 1/3은 뒤쪽의 상부 흉부 부분에 2센티미터 정도 3센티미터 를 면도합니다.
다음으로, 수술에 사용될 멸균 필드를 준비하고 필요한 모든 소모품을 준비합니다. 해밀턴 주사기를 멸균 DMEM F12 미디어로 플러시하여 세포 손실을 방지합니다. 기증자 물질의 전체 부피를 각 조건에 대해 별도의 주사기에 적재합니다.
주사기가 완전히 적재된 후, 그것을 뒤집어 서 플런저를 약간 눌러 바늘 끝에서 기포를 제거하십시오. 시술 내내 주사기를 얼음 위에 보관하십시오. 동물이 단단한 발가락 핀치로 깊은 자극에 응답하지 않는 상태로 유지되도록하십시오.
그런 다음 날카로운 수술 블레이드를 사용하여 작은 상호 절개를 합니다. 방향에 대한 내측 혈관을 찾아 서 집게를 사용하여 절개 한쪽에 피부를 들어 올립니다. 지방 패드에서 피부를 잡고 이식이 수행되는 동안 기본 갈색 지방을 피하십시오.
다음으로, 접목 부위에 바늘을 삽입한다. 조심스럽게 중간 백색 지방 패드 조직에 세포 혼합물의 40 마이크로 리터를 주입. 바늘을 천천히 제거합니다.
조직을 제자리에 잡고 이식된 세포가 3~5초 동안 정착할 수 있도록 합니다. 이식의 두 번째 부위에 이전에 설명된 대로 전체 주사 절차를 반복한다. 그 후 상처 클립이나 봉합사를 사용하여 수술 상처를 닫은 다음 마취를 중단하십시오.
동물을 희생한 후 해부를 준비하십시오. 늑갑 지방 패드의 이식 부위를 분리하는 내측 혈관을 식별합니다. 전체 패드를 하나의 조직으로 소비합니다.
조직을 양전하 현미경 슬라이드에 놓고 전체 마운트를 위한 것입니다. 7~10일 동안 슬라이드를 70%에탄올에 놓아 조직을 탈지방으로 정합니다. 그런 다음 명반 카민 얼룩을 준비하고 조직이 충분히 불투명할 때 슬라이드를 처리합니다.
처리가 완료되고 슬라이드의 조직이 지워지면 저전력 광 현미경 검사법 또는 고해상도 디지털 사진을 사용하여 분석을 위해 슬라이드 이미지를 수집합니다. 이 연구에서는, 유방 상피 세포는 기증자 쥐에서 고립된 유방 상피 오르간이 수신자 쥐의 중간 카피 백지방 패드로 이식되는 쥐와 함께 작동하기 위해 최적화된 기술을 사용하여 이식됩니다. 실험 변수와 관련된 효과의 자율성뿐만 아니라 실험의 성공여부를 결정하기 위해 상피의 존재, 부재 또는 풍부를 평가할 수 있다.
각 인자가 야생 유형 대 녹아웃과 같은 두 가지 수준이 있는 상호 이식 실험은 가설 테스트를 위해 4개의 이식 그룹을 생성합니다. 여기에 표시된 대표적인 전체 장착 된 늑간 지방 패드는 이식의 두 부위에서 긍정적 인 상피 아웃 성장을 포함합니다. 슬라이드를 분석할 때, 많은 견본에 걸쳐 늑갑 지방 패드에 있는 상피의 부족은 절차에 기술적인 문제를 표시할 수 있고 부정적인 결과로 취급되어야 합니다.
기증자 상피 아웃성장은 또한 내인성 유방 선에 비교될 수 있고 추가 결론을 촉진할 수 있습니다. 여기에 나타난 예에서, 야생형 및 CDKN1B 녹아웃 쥐를 이용한 상호 이식의 결과는 유방선 발달에 비유방 세포 자율효과를 제안했다. 기증자 상피 세포와 오르가노이드는 신중하게 준비하고 받는 동물에 주입 될 때까지 살아 있어야합니다 기억하십시오.
미리 계획하고 중단없이 신중하게 절차를 수행하는 것이 필수적입니다. 1 차적인 발암성 분석은 유방암의 병인학 또는 처리에 있는 유방 세포 자율성을 심문하기 위하여 이식 다음 수행될 수 있습니다. 유전자 편집은 또한 기증자 세포 또는 수령쥐를 유전적으로 설계하기 위하여 통합될 수 있습니다.
쥐에서 유방 상피 세포 이식을 수행하는 유일한 방법으로, 이 절차는 유방 선 발달뿐만 아니라 발암 성 연구를 용이하게합니다. 이 기술은 호스트 마이크로 환경과 유방암 세포 및/또는 유방 상피 세포 사이 상호 작용을 연구하기 위해 특히 중요합니다. 그것은 유방 선 발달뿐만 아니라 유방암 연구에 있는 연구 결과를 가능하게 합니다.
처음으로 이 기술을 시도하는 사람들은 최대 세포 수율과 생존력을 보장하기 위해 기증자 세포 준비를 최적화한 다음 수술 절차를 연습하고 세포 수를 결정하고 실험에 필요한 수술 후 잠복기를 결정해야합니다.
