1. إعداد زرع الطلائية يمكن زرعها الطازجة أو المجمدة الأنسجة الطلائية المانحة إلى منصة الدهون تطهيرها ، ولكن إعداد مسبق من الجهات المانحة ظهارة المجمدة هو أكثر ملاءمة مع انخفاض الحد الأدنى من الكفاءة في زرع (&gt; كفاءة 85 ٪). بروتوكول لإعداد ظهارة المانحة المجمدة على النحو التالي : قبل إعداد المانحة ظهارة زرع ، وإعداد وسائل الاعلام عن تجميد ظهارة وقسامة حول 1ml الى cryovials. ويمكن تخزين هذا في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر لحين الحاجة إليها. تجميد وسائل الاعلام وسائل الاعلام يتضمن DMEM/F12 مخزنة مع HEPES وNaHCO 3 ، 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، وثنائي ميثيل sulphoxide 10 ٪ (DMSO). حصاد ظهارة الثديية من الماوس الأنثى الموت الرحيم في الآونة الأخيرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الفأر مع EtOH 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اجراء خفض منتصف السهمي من خلال جدار الجسم تمتد من العانة إلى القص دون اختراق الأغشية المصلية من التجويف البطني الجسم. إجراء خفض المائل من شق الأولية في كل اتجاه العانة الساق الخلفية (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر جدار الجسم بعيدا عن الأغشية المصلية للكشف عن ال 5 الغدة الثديية الأربية التي تعلق على لفافة على الجانب السفلي من جدار الجسم. أفضل طريقة لتحقيق ذلك هي عن طريق استيعاب الأغشية المصلية بعناية مع الجزء المنحني من زوج من ملقط المنحني ، والحرص على عدم تخترق تجويف الجسم البطني. في نفس الوقت ، فهم على حافة قطع من إهاب مع ملقط مسنن مستقيم وسحب جدار الجسم بعيدا عن الأغشية المصلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد العقدة الليمفاوية في الغدة الثديية. تقع العقدة الليمفاوية عند تقاطع ثلاثة الأوعية الدموية بارزة في الغدة الثديية ، ويمكن أن يشعر بأنه العقيدات الكثيفة داخل لوحة الدهون (الشكل 2). مع غيض من مقص العين ، وارتشف من الأنسجة الدهنية المحيطة العقدة. مع إصبع الصدارة على الجانب البشرة من الجلد ، والضغط لرفع عقدة الخروج من لوحة الدهون وقرصة تشغيله مع زوج من ملقط منحنية. تجاهل العقدة الليمفاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين عقد على هامش الجلد ، فهم سادة الثديية الدهون مع الحافة المنحنية من زوج من ملقط المنحنية وقشر تدريجيا لوحة الدهون بعيدا عن جدار الجسم. اتبع اتجاه لوحة الدهون نحو السطح الظهري للفأرة أثناء إزالة الغدة الثديية بالكامل في قطعة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الغدة الثديية على كتلة قطع بلاستيكية معقمة. إضافة كمية صغيرة من وسائل الإعلام ، نحو 200 ميكرولتر ، على سطح غدة لإبقائها رطبة. فرم الغدة الى قطع 1MM بشفرة حلاقة جديدة. تقسيم الغدة مفروم إلى أربعة أجزاء وتوزيعها بين أربعة وسائل الإعلام cryovials تجميد بالملقط. وضعت في الفريزر cryovials Nalgene السيد &quot;خلية متجمد الذي 250ml من الكحول الآيزوبروبيل في المقصورة الخارجي. ضع الثلاجة في الفريزر Nalgene -70 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. مخزن القنينات المجمدة للأجزاء الثدي في النيتروجين السائل حتى اللازمة ل الزرع. وسيكون لكل cryovial تحتوي على أجزاء الغدة الثديية بما يكفي لزرع في منصات الدهون التي تم تطهيرها من الفئران المضيف 4-8. </li></ol> 2. إعداد زرع خلايا وقد زرع مختبرنا أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك خلدت الثدي خطوط الخلايا الظهارية ، خطوط الخلايا الثديية أو ورم الخلايا الثديية الأولية إلى وسادة ماوس مسح الدهون. بروتوكول لإعداد الفاصلة - D لزرع الخلايا كما يلي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستزرع فاصلة - D الخلايا في وسائل الإعلام العادية التي تحتوي على MECL DMEM : F12 تستكمل مع 2 ٪ الكبار المصل البقري (ABS) ، mEGF ، الانسولين ، مضاد حيوي / مضاد فطري (AB / ص). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الفاصلة - D الخلايا عندما كانت الخلايا 85 ٪ -90 ٪ متموجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق خلية في 1200rpm لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام MECL الطازجة وضبط تركيز الخلية إلى 5 × 10 6 / مل. </li></ol> لزرع الخلايا الثديية الأولية ، ويتم عزل الخلايا الظهارية الأولية من الغدد الثديية الماوس الثدي خلال ال 5 تفارق الميكانيكية والأنزيمية. ومعلق الخلايا في DMEM : وسائل الإعلام F12 وتعديلها لتركيز المطلوب ، وعادة 5 × 10 6 مل /. 3. المعيار الداخلي للمقاصة لوحة الماوس فات الثديية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الثلاثة الماوس الاسبوع المضيف القديمة. حدد الفئران التي هي &lt;12 ز لضمان ألا يكون قد بدأ النمو الأقنية الثديية. نستخدم 200mg/kg من وزن الجسم من ثلاثي بروم إيثانول ، 2،2،2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الفأر هو تخدير ، وكبح جماح بحزم الماوس ، الجانب البطني مع الاطراف الممدودة ، على مسرح العمليات الجراحية في البطن بحيث يتم التهكم. قبل الجراحة ، ويدير المسكنات ، إما بوبيفاكايين (&lt;1mg/kg) أو البوبرينورفين (0.05mg/kg) ، تحت الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم الجلد بالملقط بضعة ملليمترات فوق الحوض ورفع الامر من البطن<html> . ارتشف الجلد مع مقص ، واجراء خفض منتصف السهمي من خلال جدار الجسم تمتد من العانة إلى القص. لا يخترق الأغشية المصلية من تجويف الجسم البطني. لا تجعل شق الأولي قريبة جدا من مجرى البول بحيث مقاطع الجرح لن تتدخل مع قدرة الماوس ، للتبول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من شق الأولية ، وجعل التخفيضات المائل عن طريق الجلد من خط منتصف الحوض عبر كل منهما في اتجاه الساق الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المنطقة المنحنية المقوسة لملقط لفهم بلطف الأغشية المصلية. استخدام ملقط الأنسجة لفهم الهامش قطع من الجلد وسحب جدار الجسم بعيدا عن الأغشية المصلية وفضح الموافق 5 الغدة الثديية الأربية الموجود على لفافة على الجانب السفلي من جدار الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يكوي الحلمة ، واثنين من عقدة الشرايين المؤدية إلى العقدة (الشكل 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الغدد الرابع والخامس. يكوي هامش الغدة الخامس لمنع نشوب من الغدة 6 عشر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم لوحة الدهون من الغدة الثديية الرابع عبر لوحة قطع مع مقص الدهون البطنية فقط (نحو الجانب الحلمة) من العقدة. استخدام ملقط منحنية لنتشبث الجزء البطني لوحة الدهون وتسحبه بعيدا عن جدار الجسم في قطعة واحدة. اضغط على بطني جزء من لوحة الدهون بين شريحتين وضعت في طبق زجاج تلوين الأنسجة التي تحتوي على مثبت في Carnoy. سيتم إصلاح هذا النسيج الملون والحل في وقت لاحق مع الشب القرمز للتحقق من مسح الهوامش (الشكل 3). تنظيف اللفافة في انحاء المنطقة من إزالة جزء من لوحة الدهون لإزالة كل أثر للغدة الثديية مع ملقط منحنية. </li></ol> 4. بديل &quot;الإنقاذ الداخلي للمقاصة لوحة فات بعد واحد أصبح المختصة للإجراءات موحدة لتبادل المعلومات على لوحة الماوس الدهون الثدي ، فإنها قد تفضل أن الإجراء محاولة تجنيب أقل الغازية التي طورتها بريل وآخرون (2008) 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الماوس كما لإجراء القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم الحلمة من الغدة الثديية fourth الأربية وخفض محيط 3-5 ملم دائرة حول الحلمة مع غيض من المقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الحلمة بعيدا عن الجسم لفصل جزء من قطع الجلد واستخلاص الرابع الغدة الثديية الأربية من خلال الثقب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد العقدة. استخدام مكواة ليكوي العقدة والغدة الثديية ال 6 من خلال الثقب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قص وفصل الجزء الأكثر سطحية من الغدة الثديية 5 عشر قبل العقدة. تتم إزالة الحلمة ، منطقة دائرية من جلد وجزء من لوحة ظهارة تحتوي على الدهون الثدي في قطعة واحدة. </li></ol> 5. نسيج / زرع الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لشظايا ظهارة زرع ، تذويب a cryovial من ظهارة ونقل إلى شظايا الظهارية طبق بتري تحتوي على وسائط الإعلام الجديدة لتخفيف خارج DMSO. جعل ثقب صغير في الجيب أو وسادة من الدهون مسح مع تلميح مقص للظهارة جديدة. وضع قطعة من 1MM ظهارة المانحة في جيب مع ملقط الإبرة. عقد جيب مغلقة مع ملقط الأنسجة كما كنت سحب الإبرة حتى ملقط النسيج لا يزال في مكانه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لزرع الخلايا ، وضخ خلايا 50000 في 10 ميكرولتر من وسائل الإعلام في كل لوحة من الدهون باستخدام حقنة هاميلتون 50μl مع إبرة قياس 22s. </li></ol> 6. إغلاق / إحياء ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب الجلد لاقفاله. فهم يعارضون هامش الجلد ، وتحميلهم معا بالملقط ، ورفع لهم بعيدا عن الأغشية المصلية من تجويف الجسم بطني وثيق مع مقاطع الجرح. عادة ، فمن الضروري استخدام اثنين من لقطات لإغلاق شق منتصف السهمي ومقطع واحد عن كل شق مائل للإجراءات القياسية. تجنب عرقلة مجرى البول. قد يكون من الضروري سد الثغرات في الجلد عند تقاطع للشقوق منتصف السهمي والمائل مع الخيط. وسوف يجنب هذا الإجراء لا يتطلب سوى مقطع واحد عن جرح كل جانب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . ضع الماوس في قفص لها والحفاظ على قفص تحت مصباح التدفئة حتى الماوس أحيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب إزالة مقاطع الجرح بعد 2 أسابيع. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. عرض لنمط الشق. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. موقع العقدة الليمفاوية والأوعية الدموية والحلمة وظهارة الذاتية. يكوي في المواقع المشار إليها. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. يشن الجامعة يوضح أن يقتصر ظهارة الذاتية الى المنطقة ضمن دائرة ، وبالتالي الهوامش &quot;واضحة&quot;. 7. ممثل النتائج _r.jpg &quot;بديل =&quot; الشكل 4 &quot;/&gt; الشكل 4. يشن الجامعة للسادة الدهون إزالة الماوس من 3 أسابيع من العمر تظهر هوامش تطهيرها. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. يشن الجامعة من ماوس الأسبوع 10 من العمر تظهر لوحة تطهيرها من الدهون الذاتية ظهارة الثديية. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="الشكل 6" /> الشكل 6. الهيماتوكسيلين ويوزين القسم الملون من سادة من الدهون تنظيفها من ماوس الأسبوع 10 من العمر. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="الشكل 7" /> الشكل 7. يشن الجامعة من ماوس الأسبوع 10 من العمر تظهر شجرة طبيعية الأقنية الثديية تطورت من ظهارة المزروعة. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="الشكل 8" /> الشكل 8. الهيماتوكسيلين ويوزين القسم الملون من القنوات الثديية تطورت من ظهارة المزروعة. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="الشكل 9" /> الرقم 9. الهيماتوكسيلين ويوزين القسم الملون من ورم الثدي المتقدمة من ظهارة المزروعة.

<ol>
	<li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice.">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li><li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis.">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li><li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development.">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li><li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -. L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li><li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer.">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li><li>Wagner, K. -. U., Boulanger, C. A., Henry, S. g. a. g. i. a. s., Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females:+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal.">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li><li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB/c-Trp53+/-+mice.">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li></ol>

في هذا التقرير ، نقدم طريقتين بديل لإزالة الدهون وسادة الماوس الثدي في التحضير لعمليات زرع الثدي الظهارية. وقد تم إجراء القياسية في استخدام تطورها منذ عام 1959 من قبل DeOme آخرون 1 بينما أكثر الغازية ، والأسلوب القياسي هو الأسلوب المفضل لتدريب المبتدئين لأن يت?...

mammary epithelial transplant procedure

توضح هذه المقالة ويقارن إزالة الدهون سادة الداخلي التي وضعها آخرون DeOme بن كيلو بايت. (1) وتجنيب الداخلي التي وضعها بن بريل وآخرون ب 2 ، يليها إجراء عملية زرع الثدي الظهارية. ويستخدم على نطاق واسع من قبل إجراء زراعة ثدي الأحياء الثديية لأنه يستفيد من حقيقة أن تطور هام للظهارة الثديية لا يحدث إلا بعد البلوغ. في 3 أسابيع من العمر ، وينحصر نمو شجرة الثدي الظهارية في محيط الحلمة وسادة خالية من الدهون إلى حد كبير من ظهارة الثديية ، ولكن بنسبة 7 أسابيع من عمر شجرة الظهارية الأقنية تمتد في جميع أنحاء منصة الدهون بأكمله. ولذلك ، إذا كان هذا جزء صغير من لوحة تحتوي على الدهون ظهارة ، تتم إزالة المنطقة الواقعة بين الحلمة والعقدة الليمفاوية ، في 3 أسابيع من العمر ، وسوف ظهارة الذاتية أبدا ملء الوسادة الثديية الدهون ، ويوصف لوحة الدهون بأنه &quot;تطهير &quot;. في هذا الوقت ، يمكن زرع الثدي ظهارة من مصدر آخر في لوحة الدهون تطهيرها حيث لديه القدرة على تمديد أشجار الأقنية الثديية من خلال الخروج من لوحة الدهون. وقد استخدم هذا الإجراء في نماذج تجريبية كثيرة بما في ذلك دراسة النمط الظاهري ورم في الأنسجة الطلائية ثديية معدلة وراثيا من دون آثار الخلط الجيني للحيوان كامل على 3 ، في التعرف على الخلايا الجذعية الثديية عن طريق زرع الخلايا في تخفيف محدود 4،5 ، وتحديد إذا العقيدات المفرطة التصنع المضي قدما لأورام الثدي 6 ، وتقييم تأثير هرمون قبل التعرض على سلوك ظهارة 7،8 الثديية. ثلاثة فئران الاسبوع المضيف القديمة تخدير ، وتنظيفها وقيدا على مسرح العمليات الجراحية. يتم إجراء شق في منتصف السهمي من خلال الجلد ، ولكن ليس في الغشاء البريتوني ، وتمتد من العانة إلى القص يتم إجراء تخفيضات المائل عن طريق الجلد من شق منتصف السهمي عبر الحوض تجاه كل ساق. يتم سحبها بعيدا عن الجلد البريتوني لفضح 4 الغدة الثديية الأربية. مسح لوحة الدهون عن طريق إزالة الأنسجة الدهنية لوحة سابقة لالعقدة الليمفاوية. يتم زرع أجزاء ظهارة أو الخلايا الظهارية في لوحة المتبقية من الدهون التي تم تطهيرها وإغلاق الماوس.

Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial Transplant Procedure at JoVE.com

Mammary Epithelial Transplant Procedure

هذا المقال يدل على وضعها الداخلي كيلوبايت DeOme<em&gt; وآخرون.</em&gt; (1959) والإجراءات التي وضعتها تجنيب B بريل<em&gt; وآخرون.</em&gt; (2008) لتطهير الأربية الثديية 4 من الدهون وسادة ماوس محتلم استعدادا لزرع أجزاء الثدي ، الخلايا الظهارية الثدي ، أو الخلايا السرطانية الثديية.

زرع الثدي الداخلي طلائي

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Research

JoVE Journal

Biology

30.9K Views.  University of Massachussetts. هذا المقال يدل على وضعها الداخلي كيلوبايت DeOme وآخرون. (1959) والإجراءات التي وضعتها تجنيب B بريل وآخرون. (2008) لتطهير الأربية الثديية 4 من الدهون وسادة ماوس محتلم استعدادا لزرع أجزاء الثدي ، الخلايا الظهارية الثدي ، أو الخلايا السرطانية الثديية.

Video: Mammary Epithelial Transplant Procedure

Investigating the Immunological Mechanisms Underlying Organ Transplant Rejection

التحقيق في آليات مناعية الكامنة وراء رفض زرع الأعضاء

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

الخلايا الظهارية الثديية شكل الماوس Mammospheres خلال التمايز المولد للبن

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4 has resulted in important insights into mechanisms of metastatic behavior such as migration, invasion and intravasation of tumor cells5, 6, angiogenesis3 and immune cells response7-9. We have recently reported a technique to image orthotopic mammary carcinomas over multiple intravital imaging sessions in living mice10. For this, we have developed a Mammary Imaging Window (MIW) and optimized imaging parameters for Dendra211 photoswitching and imaging in vivo. Here, we describe the protocol for the manufacturing of MIW, insertion of the MIW on top of a tumor and imaging of the Dendra2- labeled tumor cells using a custom built imaging box. This protocol can be used to image the metastatic behavior of tumor cells in distinct microenvironments in tumors and allows for long term imaging of blood vessels, tumor cells and host cells.

Intravital photoswitching and tracking of Dendra2-labeled tumor cells through the Mammary Imaging Window is a technique which allows us to image the metastatic behavior of tumor cells in chosen tumor microenvironments over a timescale of days.

Dendra2 Photoswitching من خلال نافذة التصوير الثديية

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

Right Hemihepatectomy by Suprahilar Intrahepatic Transection of the Right Hemipedicle using a Vascular Stapler

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after preparing the extrahepatic hilar structures within the hepatoduodenal ligament, even in benign tumours or liver metastasis.1-5. Regional extrahepatic lymphadenectomy is an oncological standard in hilar cholangiocarcinoma, intrahepatic cholangio-cellular carcinoma and hepatocellular carcinoma, whereas lymph node metastases in the hepatic hilus in patients with liver metastasis are rarely occult. Major disadvantages of these procedures are the complex preparation of the hilus with the risk of injuring contralateral structures and the possibility of bleeding from portal vein side-branches or impaired perfusion of bile ducts. We developed a technique of right hemihepatectomy or resection of the left lateral segments with intrahepatic transection of the pedicle that leaves the hepatoduodenal ligament completely untouched. 6 However, if intraoperative visualization or palpation of the ligament is suspicious for tumor infiltration or lymph node metastasis, the hilus should be explored and a lymphadenectomy performed.

This video describes a right hemihepatectomy with intrahepatic transection of the right hemipedicle leaving the hepatoduodenal ligament completely untouched.

استئصال نصف الكبد عن طريق الحق Transection داخل الكبد Suprahilar من Hemipedicle الحق باستخدام دبابيس الأوعية الدموية

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (ACT) في الفحص القيطم المورق</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

عزل الخلايا الظهارية الثديية من ثلاثي الأبعاد الخلايا المختلطة الجسم الشبه الكروي ثقافة المشارك

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

الطريقة Cryosectioning لتسليخ مجهري الفئران القولون الغشاء المخاطي

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.