Bu protokol 40 yılı aşkın bir süredir kullanılmaktadır ve sıçanda meme hücre nakli tahlilleri için tek güvenilir yöntem olmaya devam etmektedir. Bu yöntem yaygın meme kanseri duyarlılık araştırmalarında meme hücresi otonom karşı konak etkileri sorgulamak için kullanılır. Interscapular yağ yastığı aşılama ile, bu yöntem sıçanlarda etkili değildir endojen membran epitel temizlemek zorunda atlatır.
Bu nedenle yöntem daha az invaziv ve endojen meme bezleri bir iç kontrol olarak kullanılabilir. Bu işlem başlamak için, sırtına bir ötenazi dişi sıçan yerleştirin ve iğneler ile güvenli. Sprey tüm ventral yüzey% 70 etanol ile.
Torasik erişim sağlayan bir sagittal Y şeklinde kesi olun, karın, ve inguinal meme bezleri. Donör sıçan tüm meme bezi dokusunu incelemek ve tüm görünür lenf düğümlerini kaldırmak için makas kullanın. Sonra, meme dokusu ayıklamak için forceps kullanın.
500 mikrolitre serumsuz DMEM F12 ortam içeren etiketli 60 milimetrelik bir tabağa yerleştirin ve buzda tutun. Sonra ince meme dokusu kıyma makas kullanın. İlk olarak, dikkatli bir şekilde uygun bir pozisyonda yerleştirmek ve iğneler ile güvenli donör hayvanın vücut açın.
Sprey baş ve üst sırt% 70 etanol ile. Kafatasının tabanını bulun ve oksipital konilerlenin altına bir kesi yapın, derinin altına keskin makas yerleştirin ve başın kenarları da dahil olmak üzere kafatasından deriyi kesin. Daha sonra, kemik kesiciler veya güçlü makas kullanın oksipital frontal kemiklere orta hat boyunca kafatası kesmek için mümkün olduğunca yüzeysel ve altta yatan beyin dokusunun imha önlemek için yukarı doğru açılı olarak bıçak tutmak için emin olun.
Kemiği soymak için Rongeurs veya güçlü forceps kullanın. Her iki tarafta kemik kırmak için beyincik için aracı lateral yerleştirin. İşitsel kanalı tamamen teşhir ederek menenjlerle olan bağlantılarını kes.
Beyni kafatasından çıkarmak ve ağırlığını kaydetmek için kavisli ince uçlu forseps kullanın. Ek donör beyinler için malzemeleri taze bir başlangıç kullanın. Hemen buz üzerinde depolanan ortam eşit miktarda içeren 15 mililitrelik bir tüp aktarın.
Düşük hızda 10 ila 15 saniye boyunca beyni homojenize edin. Sonra büyük parçaları kaldırmak için homojen filtre. Sıvıyı ihtiyaç duyulana kadar buzüzerinde saklayın.
İlk olarak, 1.000 mikrolitrelik pipet ucunun ucundan bir santimetre kesin ve pipettorun üzerine manuel olarak yerleştirin. Her 60 milimetrelik çanak tan kolajenaz sindirim tüpü için kıyma donör doku aktarmak için kesilmiş bir pipet ucu kullanın. Kıymalı dokuyu bir veya iki kez yukarı ve aşağı boruyla karıştırarak hafifçe karıştırın.
Daha sonra numuneleri sallayarak kuvözde yatay bir pozisyonda sabitleyin. 200 ve 220 RPM arasında bir hızda sallayarak 37 santigrat derece 1,5 ila iki saat boyunca sindirmek için örnekler izin verin. Donör meme bezi dokusu tamamen sindirildiğinde, süspansiyonu 1,200 kez g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.
Bir pelet oluşmuştur sağladıktan sonra, yağ tabakası kaldırmak için bir pipet kullanın veya dikkatle supernatant dökün. Peleti 10 mililitre taze DMEM F12 ortamla hafifçe askıya alın. Hücreleri iyice yıkamak için bu işlemi tekrarlayın.
Her donör hayvan için 40 mikrometresüz bir 50 mililitrelik tüp hazırlayın. Süzgeci en az bir mililitre DMEM F12 media ile önceden ısla. Sonra kanal parçaları veya organoidler toplamak için filtre yoluyla hücre süspansiyon geçmek için bir pipet kullanın.
Organoidler için, sadece filtrede kalan hücreleri saklayın. Yeni bir 50 mililitrelik tüp üzerinde hücre süzgeci ters ve steril ortam herhangi bir hacim ile durulayın tüm hücreleri toplamak için gerekli. Bundan sonra, bir kez daha hücreleri pelet ve sayma için medya küçük bir hacim içinde resuspend.
Tüm nakil alıcıları için, hücre süspansiyonunun eşit hacimli ve her nakil bölgesi için %50 beyin homojenate'i birleştirerek tek bir donör malzeme toplu hazırlayın. İlk olarak, kafatasıtabanını belirleyin ve alıcı bir hayvan üzerinde vertebral sütunun başlangıcı. Omurganın aşağı yaslanmış yolun yaklaşık üçte biri, sırtın üst torasik kısmında iki santimetrelik bir alana üç santimetre tıraş.
Daha sonra, ameliyat için kullanılacak steril alanı hazırlamak ve gerekli tüm malzemeleri düzenlemek. Hamilton şırıngalarını steril DMEM F12 ortamlarıyla yıkayın ve hücre kaybını önleyin. Her durum için ayrı bir şırınga içine donör malzemenin tüm hacmi yükleyin.
Şırınga tamamen yüklendikten sonra, onu ters çevirin ve iğnenin ucundaki hava kabarcıklarını çıkarmak için pistonu hafifçe bastırın. Prosedür boyunca şırıngayı buzda tutun. Hayvan ın derin uyaranlara karşı tepkisiz kaldığından emin olun.
Sonra küçük bir interscapular kesi yapmak için keskin bir cerrahi bıçak kullanın. Oryantasyon için medial kan damarını bulun ve kesinin bir tarafındaki deriyi kaldırmak için forseps kullanın. Yağ yastığıuzak deri tutun ve nakil yapılırken altta yatan kahverengi yağ kaçının.
Sonra iğneyi greft bölgesine takın. Hücre karışımının 40 mikrolitresini interskapular beyaz yağ yastığı dokusuna dikkatlice enjekte edin. İğneyi yavaşça çıkar.
Dokuyu yerinde tutun ve nakledilen hücrelerin 3-5 saniye yerleşmesine izin verin. Daha önce transplantasyon ikinci yerinde açıklandığı gibi tüm enjeksiyon prosedürü tekrarlayın. Bundan sonra, yara klipleri veya dikişler kullanarak cerrahi yara kapatın ve daha sonra anestezi durdurun.
Hayvanı feda ettikten sonra, diseksiyon için hazırlayın. Interskapular yağ yastığında greft bölgelerini ayıran medial kan damarını belirleyin. Tek bir doku parçası olarak tüm pedi çıkar.
Tüm montaj için pozitif yüklü mikroskop slayt üzerinde doku yerleştirin. Doku yağlamak için yedi ila 10 gün boyunca% 70 etanol slaytlar yerleştirin. Sonra şap karmin leke hazırlamak ve doku yeterince opak olduğunda slaytlar süreci.
İşlem tamamlandığında ve slayttaki doku temizlendiğinde, analiz için slaytların görüntülerini elde etmek için düşük güçlü ışık mikroskobu veya yüksek çözünürlüklü dijital fotoğraf kullanın. Bu çalışmada, meme epitel hücreleri donör sıçanlardan izole meme epitel organoidler alıcı sıçanların interscapular beyaz yağ yastığı içine aşılanır sıçanlar ile çalışmak için optimize edilmiş bir teknik kullanılarak nakledilir. Epitelin varlığı, yokluğu veya bolluğu, deneyin başarısını ve deneysel değişkenlerle ilgili etkilerin özerkliğini belirlemek için değerlendirilebilir.
Her faktörün vahşi tip ekarşı nakavt gibi iki düzeyi olan karşılıklı transplantasyon deneyi hipotez testi için dört nakil grubu oluşturacaktır. Burada gösterilen temsili tüm monte interscapular yağ yastığı transplantasyon her iki sitede olumlu epitel outgrowth içerir. Slaytlar analiz edilirken, birçok örnek arasında interscapular yağ yastığı epitel eksikliği prosedür ile teknik bir sorun gösterebilir ve olumsuz bir sonuç olarak ele alınmalıdır.
Donör epitel büyüme de endojen meme bezi ile karşılaştırılabilir ve ek sonuçlar kolaylaştırabilir. Burada gösterilen örnekte, yabani tip ve CDKN1B nakavt sıçanlar kullanılarak karşılıklı transplantasyon sonuçları meme bezi gelişimi üzerinde non-meme hücre otonom etkileri önerdi. Donör epitel hücreleri ve organoidler dikkatle hazırlanmış ve alıcı hayvan içine enjekte kadar canlı tutulmalıdır unutmayın.
Önceden planlamak ve prosedürü dikkatli ve kesintisiz olarak gerçekleştirmek zorunludur. Meme kanserinin etiyolojisinde veya tedavisinde meme hücre özerkliğini sorgulamak için transplantasyon sonrası primer karsinogenez tahlilleri yapılabilir. Gen düzenleme de genetik donör hücreleri veya alıcı sıçan mühendisi dahil edilebilir.
Sıçanlarda meme epitel hücre naklinin tek yöntemi olan bu işlem meme bezi gelişimini ve karsinogenez çalışmalarını kolaylaştırır. Bu teknik özellikle meme kanseri hücreleri ve/veya meme epitel hücreleri arasındaki etkileşimleri konak mikroçevre ile araştırmak için önemlidir. Meme bezi gelişiminde ve meme kanseri araştırmalarında çalışmalara olanak sağlar.
Bu tekniği ilk kez deneyenler, maksimum hücre verimi ve canlılığını sağlamak için donör hücre preparatlarını optimize etmeli, daha sonra cerrahi prosedürleri uygulamak ve enjekte etmek için hücre sayılarını belirlemek ve ayrıca deneyler için gerekli cerrahi sonrası kuluçka sürelerini belirlemek için küçük pilot deneyler yapmalıdır.
