تجديد القلب الذاتية هي عملية ديناميكية تنطوي على أنواع الخلايا المتعددة التي تعمل معا في الحفل لتركيب استجابة قوية التجدد. النظر في تجديد الأنسجة عن طريق التصوير 3D من القلب واضحة ردا على الاصابة يمكن أن تساعد في إعادة بناء ديناميات الخلوية التي توجه هذه الاستجابة تجديد القلب. تم تصميم بروتوكولنا خصيصًا لتتبع الخلايا أثناء التطوير والتجديد.
نحن لا نتوقع أي قيود في تطبيق على نطاق واسع لدينا تطهير، وتلطيخ وتقنيات التصوير لأنواع الأعضاء الأخرى. لانسداد الشريان التاجي الناجم عن LAD، أولا تعقيم المنطقة الجراحية للجرو الوليدي تخدير يوم واحد مع محلول مطهر. إجراء شق الجلد عرضية في منطقة الصدر.
لفصل الجلد عن العضلات، استخدمي زوج من ملقط الضمادات لرفع الجلد بعناية أثناء الضغط بلطف على المقص ضد العضلات الوربية في وضع مغلق. حدد مكان الفضاء الوربي الرابع واستخدم ملقط صغيرة لجعل ثقب سطحي صغير مع الحرص على تجنب الأعضاء الداخلية. باستخدام تشريح حادة وملبس خلع الملابس، توسيع المنطقة بين العضلات الوربية فقط حتى يمكن تطبيق إصبع على الجانب الأيسر من البطن في حين عقد الفضاء الوربي مفتوحة مع ملقط خلع الملابس لتوجيه بلطف القلب للخروج من تجويف الصدر.
بمجرد استخراج القلب، والسماح للقلب للراحة على العضلات النترية وتحديد موقع LAD كمنطقة القلب مع أقل تجمع الدم. للحث على احتشاء عضلة القلب ، استخدم خياطة 6-0 لربط عقدة مربعة بإحكام حول الوعاء مرتين دون قطع الشريان. وينبغي أن يلاحظ في التبييض على الفور.
من المهم أن تبقى متسقة على وضع الغرز على طول LAD لحجم مماثل. ويتحقق ذلك على أفضل أفضل المدى من خلال الوصول إلى القلب بسرعة في حين أن الدم لا يزال يتدفق عبر الشرايين. عندما يتم وضع الغرزة، اسمح للقلب أن ينزلق مرة أخرى إلى تجويف الصدر.
خياطة الأضلاع جنبا إلى جنب مع جراح واحد وعقدة مربع واحد باستخدام ملقط حادة لرفع المجموعة العليا من الأضلاع في حين يمر خياطة 6-0 من خلال مجموعة العلوي والسفلى من الأضلاع. تطبيق حجم صغير من الغراء الجلد إلى الجزء العلوي من البطن واستخدام ملقط غرامة لوضع الجلد من أسفل البطن على منطقة الصدر المكشوفة. ثم ضع الجرو على وسادة التدفئة وأداء الربط على الحيوان المقبل.
عندما يتم إجراء جميع العمليات الجراحية، إعادة الجراء الدافئة والمتحركة إلى قفص الأم المنزلي. للوضوح السلبي من أنسجة القلب المحصودة، 21 يوما بعد الجراحة بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القار، ووضع الماوس على منطقة جراحية نظيفة في موقف supine وتأمين الأطراف مع الشريط. باستخدام ملقط الأنسجة، فهم الفراء فقط تحت عملية xiphoid وجعل شق يمتد عرض القفص الصدري.
قطع جنبا إلى جنب مع أجزاء من القفص الصدري واستخدام ملقط لرفع عملية xiphoid لفضح الحجاب الحاجز. فصل الحجاب الحاجز مع ملقط منحني وسحب الأنسجة كريا حتى يمكن الوصول إلى القلب النابض. استخدام ملقط منحني لفهم القلب في قاعدة واستخدام مقص استئصال iriddectomy لقطع الشريان الأبهر و الأجوف الأجوف فينا متفوقة.
وضع القلب النابض في طبق بيتري من برنامج تلفزيوني بحيث يضخ القلب أي دم محتفظ به. يمكن تأكيد احتشاء عضلة القلب من خلال وضع تشريحي صحيح لأربطة LAD. عندما يتوقف القلب عن النبض ، اضغط بلطف على العضو باستخدام ملقط لطرد الدم المتبقي ونقل العينة إلى قارورة زجاجية يمكن التخلص منها 2.5 ملليلتر تحتوي على ملليلترين من PBS.
ضع القارورة على شاكر لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة تغيير حل PBS كل 10 دقائق حتى يبقى الحل واضحًا من الدم. عندما يكون برنامج تلفزيوني واضح، استبدال برنامج تلفزيوني مع ملليلتر اثنين من بارد 4٪ شبهformaldehyde لمدة أربع ساعات حضانة في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة يغسل 10 دقيقة على شاكر مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني الطازجة في غسل. بعد الغسيل الأخير، ملء القارورة مع مليلترين من 4٪ أكريلاميد تكملها 0.5٪ VA-044 حل لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي، ضع القارورة في كتلة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. في نهاية البلمرة، نقل القلب إلى قارورة قذيفة زجاجية جديدة وغسل أنسجة القلب في مليلترين من برنامج تلفزيوني الطازجة 10 دقيقة في وقت منعش برنامج تلفزيوني في نهاية كل حضانة. عندما يكون PBS واضحًا، استبدل مخزن الغسيل بمحل إزالة المليلترين.
احتضان العينة في 37 درجة مئوية لعدة أسابيع حتى القلب هو واضح، منعش حل المقاصة كل يومين إلى ثلاثة أيام. عندما يكون العضو واضحًا ، اغسل العينة مع PBS على الشاكر كما هو موضح قبل إعادة ملء القارورة بـ PBS جديدة لمدة 24 ساعة في حضانة عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استبدل برنامج تلفزيوني مع RIMS لاحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة ، يتم مسح الأنسجة بالكامل. وينبغي أن تصبح شفافة الأنسجة بعد عدة أسابيع. لتصوير قلب فأر ما بعد الولادة بعد تحريض احتشاء عضلة القلب، املأ نصف غرفة شريحة الاكتئاب المصنوعة خصيصًا مع PBS واستخدم ملقطًا منحنية لنقل القلب المصفى بعناية إلى الغرفة.
ملء وحدة التخزين المتبقية من الغرفة مع برنامج تلفزيوني. ثم ملء الغرفة مع برنامج تلفزيوني حتى سطح السائل يشكل قبة فوق الجزء العلوي من الغرفة وجبل الشريحة الغطاء قبل تصوير الأنسجة عن طريق المجهر confocal وفقا لبروتوكولات التصوير القياسية. إذا كان الثقب وتشريح حادة قريبة جدا في القرب من القص، قد لا يكون القلب قادرا على الخروج من تجويف الصدر.
إذا كان القلب لا يخرج بسهولة من التجويف ، فضغط على البطن الأيسر لتسهيل العملية. قد تحدث مضاعفات من يستريح القلب على العضلات الوربية. لذلك ، من المهم الحفاظ على تشريح حاد إلى الحد الأدنى من الحجم في اتجاه أفقي للسماح لتصور واضح وسهولة الوصول إلى LAD.
لاحظ أن الربط السطحي سيكون أقل مساحة للتكيف في وضع خياطة النهائي وأنه ينبغي إجراء خياطة ربط حول LAD مع حركات ثابتة تسيطر عليها. في نهاية خطوة المقاصة ، يجب أن يكون القلب بأكمله معتمًا باستمرار بدون تغير في الوسط. بعد بضعة أيام في حل RIMS في درجة حرارة الغرفة، يجب أن يتم مسح القلب تماما ويمكن ملاحظة بعض توسع الأنسجة.
كما لوحظ من قبل tdTomato التعبير عن البروتين مراسل، والأعصاب القلبية هي سطحية أساسا مع بعض السكان المقيمين في طبقة epicardial. الأهم من ذلك، يتم الحفاظ على تأكيد التعبير عن البروتين مراسل بعد خضوعه لبروتوكول وضوح كما هو موضح. تطهير وتصوير القلب 3D يوفر منظور في الموقع ومورفولوجيا مجموعات الخلايا القلبية.
وهذا يسمح لنا لتحديد جوانب جديدة في الخلية النقش والتفاعلات الخلية الخلية.
