Endojen kalp rejenerasyonu, sağlam bir rejeneratif yanıt monte etmek için birlikte çalışan birden fazla hücre tipini içeren dinamik bir süreçtir. Yaralanmaya yanıt olarak temizlenmiş kalbin 3Boyutlu görüntüleme yoluyla rejenerasyon doku içine bakan bu kardiyak rejeneratif yanıt rehberlik hücresel dinamiklerin rekonstrüksiyonu yardımcı olabilir. Protokolümüz özellikle geliştirme ve rejenerasyon sırasında hücreleri izlemek için tasarlanmıştır.
Temizleme, boyama ve görüntüleme tekniklerimizi diğer organ tiplerine yaygın olarak uygulamakta herhangi bir sınırlama öngörmüyoruz. LAD'ye bağlı koroner arter tıkanıklığı için, önce anestezili bir günlük yenidoğan yavrusunun cerrahi alanını antiseptik solüsyonla sterilize edin. Göğüs bölgesinde enine deri kesiyapın.
Kas cildi ayırmak için, hafifçe kapalı bir pozisyonda interkostal kaslara karşı makas basarak cildi dikkatle kaldırmak için pansuman forseps bir çift kullanın. Dördüncü interkostal alanı bulmak ve iç organları önlemek için özen küçük bir yüzeysel delinme yapmak için küçük çalgılar kullanın. Künt diseksiyon ve pansuman forceps kullanarak, bir parmak yavaşça göğüs boşluğundan kalp rehberlik etmek için pansuman forceps ile interkostal boşluk açık tutarken karın sol tarafına uygulanabilir kadar interkostal kaslar arasındaki alanı genişletmek.
Kalp çıkarıldıktan sonra, kalp interkostal kaslar üzerinde dinlenmek ve daha az birikmiş kan ile kalbin bölge olarak LAD bulmak için izin verin. Miyokard enfarktüsü neden olmak için, arter kesmeden damar etrafında iki kez sıkıca bir kare düğüm bağlamak için 6-0 dikiş kullanın. Tepede beyazlatma hemen gözlenmelidir.
Benzer bir enfarkt boyutu için LAD boyunca dikiş yerleşimi tutarlı kalmak önemlidir. Bu en iyi kan hala arterler üzerinden akan ise hızlı bir şekilde kalbe erişerek elde edilir. Dikiş yerleştirildiğinde, kalbin göğüs boşluğuna geri kaymasına izin verin.
Kaburgaların üst ve alt setinden 6-0'lık bir dikiş geçerken kaburgaların üst setini kaldırmak için künt forseps ler kullanarak kaburgaları bir cerrah ve bir kare düğüm le birlikte dikin. Üst karın deri tutkal küçük bir hacim uygulayın ve maruz göğüs bölgesi üzerinde alt karın cilt konumlandırmak için ince forceps kullanın. Sonra bir ısıtma yastığı üzerinde yavru yerleştirin ve bir sonraki hayvan üzerinde ligasyon gerçekleştirmek.
Tüm ameliyatlar yapıldığında, sıcak ve hareketli yavruları annenin kafesine geri getirin. Hasat edilen kalp dokusunun pasif netliği için, 21 gün ameliyat sonrası parmak ucuna yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra fareyi supine pozisyonunda temiz bir cerrahi alana yerleştirin ve uzuvları bantla sabitleyin. Doku forceps kullanarak, xiphoid sürecinin hemen altında kürk kavramak ve göğüs kafesi genişliğikapsayan bir kesi yapmak.
Göğüs kafesinin distal kısımlarının yanında kesin ve diyaframı ortaya çıkarmak için xiphoid işlemini kaldırmak için forsepskullanın. Diyaframı kavisli forceps ile ayırın ve atan kalp erişilebilir olana kadar kafatasında doku çekin. Tabanında kalp kavramak ve aort ve üstün vena kava kesmek için iridektomi makas kullanmak için kavisli forceps kullanın.
Atan kalbi PBS'nin Petri kabına yerleştirin, böylece kalp tutulan kanı dışarı pompalar. Miyokard enfarktüsü LAD ligasyonunun doğru anatomik yerleşimi ile doğrulanabilir. Kalp durduğunda, kalan kanı atmak için organı forsepslerle hafifçe sıkın ve numuneyi iki mililitre PBS içeren tek kullanımlık 2,5 mililitrelik cam kabuk şişesine aktarın.
Çözelti kandan temiz kalana kadar şişeyi oda sıcaklığında pbs çözeltisini her 10 dakikada bir değiştirerek en az 30 dakika çalkalayıcıüzerine yerleştirin. PBS temiz olduğunda, oda sıcaklığında dört saatlik bir kuluçka için iki mililitre soğuk 4%paraformaldehit ile PBS değiştirin ve ardından yıkama başına iki mililitre taze PBS ile çalkalayıcıüzerinde üç 10 dakikalık yıkar. Son yıkamadan sonra, dört santigrat derecede bir gecede kuluçka için% 0.5 VA-044 çözeltisi ile desteklenen% 4 akrilamid iki mililitre ile şişe doldurun.
Ertesi gün, şişeyi 37 derecelik bir ısı bloğuna üç saat süreyle yerleştirin. Polimerizasyonun sonunda, kalbi yeni bir cam kabuk şişesine aktarın ve kalp dokusunu her kuluçka sonunda PBS'yi yenilerek bir seferde iki mililitre taze PBS 10 dakika yıkayın. PBS temizlendiğinde, yıkama tamponu iki mililitre temizleme çözeltisi ile değiştirin.
Kalbi temize gelene kadar numuneyi 37 santigrat derecede birkaç hafta kuluçkaya yatırın ve temizleme solüsyonunu her 2-3 günde bir yenileyin. Organ temizlendiğinde, numuneyi 37 santigrat derecede 24 saatlik bir kuluçka için taze PBS ile doldurmadan önce gösterildiği gibi çalkalayıcıda PBS ile yıkayın. Ertesi gün, 37 santigrat derecede 24 saatlik kuluçka için PBS'yi RIMS ile değiştirin.
Kuluçka sonunda doku tamamen temizlenir. Doku birkaç hafta sonra şeffaf hale gelmelidir. Miyokard infarktüsü sonrası temizlenmiş postnatal fare kalbinin görüntülenmesi için, özel yapım depresyon slaytının yarısını PBS ile doldurun ve temizlenmiş kalbi dikkatlice odaya aktarmak için kavisli forseps kullanın.
Haznenin kalan hacmini PBS ile doldurun. Daha sonra sıvı nın yüzeyi odanın üst kısmında bir kubbe oluşturana kadar odayı PBS ile doldurun ve standart görüntüleme protokollerine göre dokuyu konfokal mikroskopi ile görüntülemeden önce kapak kaydırağı monte edin. Delinme ve künt diseksiyon göğüs kafesine çok yakınsa, kalp göğüs boşluğundan çıkamayabilir.
Kalp kolayca boşluk tan çıkmazsa, süreci kolaylaştırmak için sol karın basınç uygulayın. Komplikasyonlar interkostal kaslar üzerinde kalp dinlenme oluşabilir. Bu nedenle, lad net bir görselleştirme ve erişilebilirlik sağlamak için yatay bir yönde en az boyutta künt diseksiyon tutmak önemlidir.
Yüzeysel bir ligasyon son dikiş yerleşiminde ayarlama için daha az yer olacak ve LAD etrafında dikiş bağlama kontrollü sabit hareketlerle yapılmalıdır unutmayın. Temizleme adımının sonunda, tüm kalp sürekli merkezinde hiçbir renk değişikliği ile opak olmalıdır. Oda sıcaklığında RIMS çözeltisinde birkaç gün kaldıktan sonra kalp tamamen temizlenmeli ve bazı doku genişlemesi gözlemlenebilir.
TdTomato muhabiri protein ekspresyonunda gözlendiği gibi, kardiyak sinirler epikardiyal tabakada yaşayan bazı popülasyonlarda çoğunlukla yüzeyseldir. Daha da önemlisi, muhabir protein ekspresyonu onayı gösterildiği gibi netlik protokolünden geçtikten sonra korunur. 3D kalbin temizlenmesi ve görüntülenmesi, kardiyak hücre popülasyonlarının yeri ve morfolojisi ile ilgili perspektif sağlar.
Bu bize hücre desenleme ve hücre-hücre etkileşimleri yeni yönlerini belirlemek için izin verir.
