La régénération endogène du cœur est un processus dynamique qui implique plusieurs types de cellules travaillant ensemble de concert pour monter une réponse régénérative robuste. Peering dans le tissu régénérant par l’imagerie 3D du coeur dégagé en réponse aux dommages peut aider à la reconstruction de la dynamique cellulaire qui guident cette réponse régénératrice cardiaque. Notre protocole est spécifiquement conçu pour suivre les cellules pendant le développement et la régénération.
Nous ne prévoyons aucune limite à l’application générale de nos techniques de compensation, de coloration et d’imagerie à d’autres types d’organes. Pour l’occlusion coronaire lad-induite, stérilisez d’abord la zone chirurgicale d’un chiot néonatal anesthésié d’un jour avec la solution antiseptique. Faire une incision transversale de la peau dans la région de la poitrine.
Pour séparer la peau du muscle, utilisez une paire de forceps de pansement pour soulever la peau soigneusement tout en appuyant doucement sur les ciseaux contre les muscles intercostals en position fermée. Localiser le quatrième espace intercostal et utiliser de petits forceps pour faire une petite ponction superficielle en prenant soin d’éviter les organes internes. À l’aide de la dissection contondante et des forceps d’habillage, élargir la zone entre les muscles intercostals jusqu’à ce qu’un doigt puisse être appliqué sur le côté gauche de l’abdomen tout en tenant l’espace intercostal ouvert avec des forceps d’habillage pour guider doucement le cœur hors de la cavité thoracique.
Une fois que le cœur a été extrait, permettre au cœur de se reposer sur les muscles intercostals et de localiser le LAD comme la région du cœur avec moins de sang mis en commun. Pour induire l’infarctus du myocarde, utilisez une suture 6-0 pour attacher un nœud carré étroitement autour du navire deux fois sans couper l’artère. Le blanchiment au sommet doit être observé immédiatement.
Il est important de rester cohérent sur le placement de suture le long du LAD pour une taille infarctus similaire. Ceci est mieux réalisé en accédant au cœur rapidement tandis que le sang coule encore à travers les artères. Lorsque la suture a été placée, laissez le cœur se glisser dans la cavité thoracique.
Suture les côtes avec un chirurgien et un noeud carré en utilisant des forceps émoussés pour soulever l’ensemble supérieur des côtes tout en passant une suture 6-0 à travers l’ensemble supérieur et inférieur des côtes. Appliquer un petit volume de colle de peau sur le haut de l’abdomen et utiliser des forceps fins pour positionner la peau du bas-ventre sur la région de la poitrine exposée. Ensuite, placez le chiot sur un coussin chauffant et effectuez la ligature sur l’animal suivant.
Lorsque toutes les chirurgies ont été effectuées, retournez les chiots chauds et mobiles dans la cage familiale de la mère. Pour la clarté passive du tissu cardiaque récolté, 21 jours de postsurgery après confirmation d’un manque de réponse au pincement d’onteil, placez la souris sur une zone chirurgicale propre dans la position supine et fixez les membres avec le ruban adhésif. À l’aide de forceps tissulaires, saisir la fourrure juste en dessous du processus xiphoïde et faire une incision couvrant la largeur de la cage thoracique.
Couper le long des parties distales de la cage thoracique et utiliser les forceps pour soulever le processus xiphoïde pour exposer le diaphragme. Détachez le diaphragme avec des forceps incurvés et tirez le tissu cranially jusqu’à ce que le cœur battant est accessible. Utilisez les forceps incurvés pour saisir le cœur à la base et utilisez des ciseaux iridectomy pour couper l’aorte et le cava vena supérieur.
Placez le cœur battant dans une boîte de Pétri de PBS de sorte que le cœur pompe tout sang retenu. L’infarctus du myocarde peut être confirmé par un placement anatomique correct de la ligature lad. Lorsque le cœur cesse de battre, presser doucement l’organe avec des forceps pour expulser le sang résiduel et transférer le spécimen dans un flacon de coquille de verre jetable de 2,5 millilitres contenant deux millilitres de PBS.
Placez le flacon sur un shaker pendant au moins 30 minutes à température ambiante en changeant la solution PBS toutes les 10 minutes jusqu’à ce que la solution reste claire du sang. Lorsque le PBS est clair, remplacez le PBS par deux millilitres de paraformaldéhyde froid de 4 % pour une incubation de quatre heures à température ambiante, suivi de trois lavages de 10 minutes sur le shaker avec deux millilitres de PBS frais par lavage. Après le dernier lavage, remplissez le flacon de deux millilitres de 4% d’acrylamide complété par une solution VA-044 de 0,5% pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, placez le flacon dans un bloc thermique de 37 degrés Celsius pendant trois heures. À la fin de la polymérisation, transférer le cœur dans un nouveau flacon de coquille de verre et laver le tissu cardiaque en deux millilitres de PBS frais 10 minutes à la fois rafraîchir le PBS à la fin de chaque incubation. Lorsque le PBS est clair, remplacez le tampon de lavage par deux millilitres de solution de compensation.
Incuber le spécimen à 37 degrés Celsius pendant plusieurs semaines jusqu’à ce que le cœur soit clair, rafraichissant la solution de compensation tous les deux à trois jours. Lorsque l’organe est clair, lavez le spécimen avec du PBS sur le shaker tel que démontré avant de remplir le flacon avec du PBS frais pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius. Le lendemain, remplacez le PBS par rims pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, le tissu est entièrement défriché. Le tissu doit devenir transparent après plusieurs semaines. Pour l’imagerie du cœur de souris postnatale effacé après l’intronisation du myocarde, remplissez la moitié d’une chambre d’une glissière de dépression sur mesure avec PBS et utilisez des forceps incurvés pour transférer soigneusement le cœur dégagé dans la chambre.
Remplissez le volume restant de la chambre de PBS. Remplissez ensuite la chambre de PBS jusqu’à ce que la surface du liquide forme un dôme au-dessus du haut de la chambre et montez la glissière de couverture avant d’imagerie du tissu par microscopie confocale selon les protocoles d’imagerie standard. Si la perforation et la dissection émoussée sont trop proches du sternum, le cœur peut ne pas être en mesure de sortir de la cavité thoracique.
Si le cœur ne sort pas facilement de la cavité, appliquez une pression sur l’abdomen gauche pour faciliter le processus. Des complications peuvent survenir en reposant le cœur sur les muscles intercostals. Par conséquent, il est important de maintenir la dissection émoussée à une taille minimale dans une orientation horizontale pour permettre une visualisation claire et l’accessibilité du LAD.
Notez qu’une ligature superficielle aura moins de place pour l’ajustement dans le placement final de suture et que la suture lissant autour du LAD devrait être exécutée avec des mouvements réguliers commandés. À la fin de l’étape de compensation, tout le cœur doit être constamment opaque sans décoloration au centre. Après quelques jours dans la solution RIMS à température ambiante, le cœur doit être complètement dégagé et une certaine expansion des tissus peut être observée.
Comme observé par l’expression de protéine de journaliste de tdTomato, les nerfs cardiaques sont principalement superficiels avec quelques populations résidant dans la couche épidardiale. Fait important, la confirmation de l’expression protéique du journaliste est préservée après avoir subi le protocole de clarté tel que démontré. Le dégagement et l’imagerie du cœur 3D offrent une perspective sur l’emplacement et la morphologie des populations de cellules cardiaques.
Cela nous permet d’identifier de nouveaux aspects dans le modelage cellulaire et les interactions cellule-cellule.
