Эндогенная регенерация сердца является динамичным процессом, который включает в себя несколько типов клеток, работающих вместе в согласовании, чтобы смонтировать надежный регенеративный ответ. Вглядываясь в регенерирующую ткань с помощью 3D-изображения очищенного сердца в ответ на травму может помочь в реконструкции клеточной динамики, которые направляют этот сердечный регенеративной реакции. Наш протокол специально разработан для отслеживания клеток во время разработки и регенерации.
Мы не предвидим никаких ограничений в широком применении наших методов очистки, окрашивания и визуализации к другим типам органов. Для окклюзии коронарной артерии, вызванной LAD, сначала стерилизовать хирургическую область обезболивающего однодневного неонатального щенка с антисептическим раствором. Сделайте поперечный разрез кожи в области грудной клетки.
Чтобы отделить кожу от мышц, используйте пару миппов для тщательного подъема кожи, нежно прижимая ножницы к межреберной мышце в закрытом положении. Найдите четвертое межреберного пространства и использовать небольшие типсы, чтобы сделать небольшой поверхностный прокол заботы, чтобы избежать внутренних органов. Используя тупое вскрытие и перевязочные миппы, расширьте область между межреберных мышц только до тех пор, пока палец не будет применен к левой стороне живота, удерживая межреберное пространство открытым с помощью мизинцев, чтобы мягко направлять сердце из грудной полости.
После того, как сердце было извлечено, позвольте сердцу отдохнуть на межреберных мышцах и найти LAD как область сердца с меньшим количеством крови. Чтобы вызвать инфаркт миокарда, используйте 6-0 шва, чтобы связать квадратный узел плотно вокруг сосуда два раза, не разрывая артерию. Бланширование на вершине следует соблюдать немедленно.
Важно оставаться последовательным на шов размещения вдоль LAD для аналогичного размера инфаркта. Это лучше всего достигается путем доступа к сердцу быстро в то время как кровь все еще течет через артерии. Когда шов был помещен, позвольте сердцу проскользнуть обратно в грудную полость.
Шов ребра вместе с одним хирургом и один квадратный узел с помощью тупых типсов, чтобы поднять верхний набор ребер при прохождении 6-0 шва через верхний и нижний набор ребер. Нанесите небольшой объем клея кожи на верхнюю часть живота и используйте тонкие миппы для положения кожи нижней части живота над открытой области груди. Затем поместите щенка на грелку и выполните перевязку на следующем животном.
Когда все операции будут выполнены, верните теплых и подвижных щенков в домашнюю клетку матери. Для пассивной ясности собранных тканей сердца, 21 дней послехирургии после подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноша, поместите мышь на чистую хирургическую область в положении на спине и обеспечить конечностей с лентой. Используя ткани типсы, понять меха чуть ниже процесса xiphoid и сделать разрез, охватывающий ширину грудной клетки.
Вырезать вместе с дистальной части грудной клетки и использовать типсы, чтобы поднять процесс xiphoid подвергать диафрагмы. Отсоедините диафрагму изогнутыми типсами и потяните ткань черепно, пока бьющееся сердце не будет доступно. Используйте изогнутые типсы, чтобы схватить сердце у основания и использовать ножницы иридэктомии, чтобы сократить аорты и превосходной кавы вены.
Поместите бьющееся сердце в чашку Петри PBS так, чтобы сердце выкачивает любую сохраненную кровь. Инфаркт миокарда может быть подтвержден правильным анатомическим размещением перевязки LAD. Когда сердце перестанет биться, аккуратно сожмите орган типсами, чтобы изгнать остаточную кровь и передать образец в одноразовый 2,5 миллилитровый стеклянный флакон оболочки, содержащий два миллилитров PBS.
Поместите флакон на шейкер, по крайней мере 30 минут при комнатной температуре изменения раствора PBS каждые 10 минут, пока раствор остается открытым от крови. Когда PBS ясно, заменить PBS с двумя миллилитров холодного 4%paraformaldehyde для четырехчасовой инкубации при комнатной температуре, а затем три 10-минутные моет на шейкер с двумя миллилитров свежего PBS за стирку. После последней стирки заполните флакон двумя миллилитров 4%акриламида, дополненных раствором 0,5%VA-044 для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия.
На следующий день поместите флакон в тепловой блок 37 градусов по Цельсию в течение трех часов. В конце полимеризации, передать сердце в новый стеклянный флакон оболочки и мыть ткани сердца в два миллилитров свежего PBS 10 минут в то время, освежая PBS в конце каждого инкубации. Когда PBS ясно, заменить буфер мытья с двумя миллилитров клирингового раствора.
Инкубировать образец при 37 градусах по Цельсию в течение нескольких недель, пока сердце не прояснит, освежая раствор очистки каждые два-три дня. Когда орган ясно, мыть образец с PBS на шейкере, как попродемонстрировано перед заправкой флакон со свежим PBS для 24-часовой инкубации при 37 градусов по Цельсию. На следующий день, заменить PBS с RIMS для 24-часовой инкубации при 37 градусов по Цельсию.
В конце инкубации ткань полностью очищается. Ткань должна стать прозрачной через несколько недель. Для визуализации очищенного послеродового сердца мыши после индукции инфаркта миокарда заполните половину камеры индивидуального слайда депрессии с помощью PBS и используйте изогнутые миппы, чтобы тщательно перенести очищенное сердце в камеру.
Заполните оставшийся том камеры с помощью PBS. Затем заполните камеру PBS до тех пор, пока поверхность жидкости образует купол над верхней частью камеры и смонтировать крышку слайда перед изображением ткани конфокальные микроскопии в соответствии со стандартными протоколами изображения. Если прокол и тупое вскрытие находятся слишком близко в непосредственной близости от грудины, сердце не может быть в состоянии выйти из грудной полости.
Если сердце не легко выйти из полости, оказать давление на левый живот, чтобы облегчить процесс. Осложнения могут возникнуть от отдыха сердца на межреберных мышцах. Поэтому важно держать тупое вскрытие до минимального размера в горизонтальной ориентации, чтобы обеспечить четкую визуализацию и доступность LAD.
Обратите внимание, что поверхностная перевязка будет иметь меньше места для корректировки в окончательном размещении шва и что швы связывания вокруг LAD должны быть выполнены с контролируемыми устойчивыми движениями. К концу расчистки шаг, все сердце должно быть последовательно непрозрачным без обесцвечивания в центре. После нескольких дней в растворе RIMS при комнатной температуре, сердце должно быть полностью очищено и некоторое расширение тканей может наблюдаться.
Как отмечает tdTomato репортер белка выражение, сердечные нервы в основном поверхностны с некоторыми популяциями, проживающих в эпикардиальный слой. Важно отметить, что подтверждение экспрессии белка репортера сохраняется после прохождения протокола ясности, как попродемонстрировано. Очистка и визуализация 3D сердца дает представление о местоположении и морфологии популяций сердечных клеток.
Это позволяет нам выявлять новые аспекты в клеточном шаблоне и взаимодействиях клеток и клеток.
