A regeneração cardíaca endógena é um processo dinâmico que envolve vários tipos de células trabalhando juntos em conjunto para montar uma resposta regenerativa robusta. Olhar para o tecido regenerador através de imagens 3D do coração limpo em resposta à lesão pode ajudar na reconstrução da dinâmica celular que guia essa resposta regenerativa cardíaca. Nosso protocolo foi projetado especificamente para rastrear células durante o desenvolvimento e regeneração.
Não prevemos limitações na aplicação ampla de nossas técnicas de limpeza, coloração e imagem a outros tipos de órgãos. Para a oclusão da artéria coronária induzida pelo LAD, esterilize primeiro a área cirúrgica de um filhote neonatal anesthetizado de um dia de idade com solução antisséptica. Faça uma incisão transversal na região do peito.
Para separar a pele do músculo, use um par de fórceps de curativo para levantar a pele cuidadosamente enquanto pressiona suavemente a tesoura contra os músculos intercostais em posição fechada. Localize o quarto espaço intercostal e use pequenos fórceps para fazer uma pequena punção superficial tomando cuidado para evitar os órgãos internos. Usando dissecção contundente e fórceps de curativo, amplie a área entre os músculos intercostais apenas até que um dedo possa ser aplicado no lado esquerdo do abdômen enquanto segura o espaço intercostal aberto com fórceps de curativo para guiar suavemente o coração para fora da cavidade torácica.
Uma vez extraído o coração, permita que o coração descanse sobre os músculos intercostais e localize o LAD como a região do coração com menos sangue agrupado. Para induzir o infarto do miocárdio, use uma sutura de 6-0 para amarrar um nó quadrado firmemente ao redor do vaso duas vezes sem cortar a artéria. Blanching no ápice deve ser observado imediatamente.
É importante permanecer consistente na colocação da sutura ao longo do LAD para um tamanho de infarto semelhante. Isso é melhor conseguido acessando o coração rapidamente enquanto o sangue ainda está fluindo através das artérias. Quando a sutura for colocada, deixe o coração escorregar de volta para a cavidade torácica.
Sutura as costelas junto com um cirurgião e um nó quadrado usando fórceps sem cortes para levantar o conjunto superior de costelas enquanto passa uma sutura de 6-0 através do conjunto superior e inferior das costelas. Aplique um pequeno volume de cola de pele no abdômen superior e use fórceps finos para posicionar a pele do abdômen inferior sobre a região do peito exposta. Em seguida, coloque o filhote em uma almofada de aquecimento e realize a ligadura no próximo animal.
Quando todas as cirurgias tiverem sido realizadas, devolva os filhotes quentes e móveis para a gaiola da mãe. Para a clareza passiva do tecido cardíaco colhido, 21 dias após a confirmação da falta de resposta ao aperto do dedo do pé, coloque o rato em uma área cirúrgica limpa na posição supina e fixe os membros com fita adesiva. Usando fórceps teciduais, segure a pele logo abaixo do processo xifoide e faça uma incisão abrangendo a largura da caixa torácica.
Corte ao lado das porções distais da caixa torácica e use os fórceps para levantar o processo xifoide para expor o diafragma. Retire o diafragma com fórceps curvos e puxe o tecido cranialmente até que o coração pulsante esteja acessível. Use as fórceps curvas para agarrar o coração na base e use uma tesoura de iridectomia para cortar a aorta e a veia cava superior.
Coloque o coração batendo em uma placa de Petri de PBS para que o coração bombeie qualquer sangue retido. O infarto do miocárdio pode ser confirmado por uma colocação anatômica correta da ligadura LAD. Quando o coração parar de bater, aperte suavemente o órgão com fórceps para expulsar o sangue residual e transferir o espécime para um frasco descartável de 2,5 mililitros de vidro contendo dois mililitros de PBS.
Coloque o frasco em um agitador por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente mudando a solução PBS a cada 10 minutos até que a solução permaneça livre de sangue. Quando o PBS estiver claro, substitua o PBS por dois mililitros de paraformaldeído frio de 4% para uma incubação de quatro horas à temperatura ambiente, seguido por três lavagens de 10 minutos no shaker com dois mililitros de PBS fresco por lavagem. Após a última lavagem, encha o frasco com dois mililitros de 4% de acrilamida suplementados com solução 0,5%VA-044 para uma incubação noturna a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, coloque o frasco em um bloco de calor de 37 graus Celsius por três horas. No final da polimerização, transfira o coração para um novo frasco de concha de vidro e lave o tecido cardíaco em dois mililitros de PBS frescos 10 minutos de cada vez refrescando o PBS no final de cada incubação. Quando o PBS estiver limpo, substitua o tampão de lavagem por dois mililitros de solução de compensação.
Incubar o espécime a 37 graus Celsius por várias semanas até que o coração esteja claro, refrescando a solução de compensação a cada dois ou três dias. Quando o órgão estiver limpo, lave o espécime com PBS no shaker como demonstrado antes de encher o frasco com PBS fresco para uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, substitua o PBS por RIMS para uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius.
No final da incubação, o tecido é totalmente limpo. O tecido deve ficar transparente depois de várias semanas. Para a imagem do coração do rato pós-natal limpo após a indução do infarto do miocárdio, preencha metade de uma câmara de um slide de depressão personalizado com PBS e use fórceps curvos para transferir cuidadosamente o coração limpo para a câmara.
Encha o volume restante da câmara com PBS. Em seguida, encha a câmara com PBS até que a superfície do líquido forme uma cúpula acima do topo da câmara e monte a lâmina de cobertura antes de imaginar o tecido por microscopia confocal de acordo com os protocolos de imagem padrão. Se a punção e dissecção contundente estiverem muito próximas ao esterno, o coração pode não ser capaz de sair da cavidade torácica.
Se o coração não sair facilmente da cavidade, aplique pressão no abdômen esquerdo para facilitar o processo. Complicações podem ocorrer por descansar o coração nos músculos intercostais. Por isso, é importante manter a dissecação contundente a um tamanho mínimo em uma orientação horizontal para permitir uma visualização clara e acessibilidade do LAD.
Observe que uma ligadura superficial terá menos espaço para ajuste na colocação final da sutura e que a sutura em torno do LAD deve ser realizada com movimentos estáveis controlados. No final da etapa de compensação, todo o coração deve ser consistentemente opaco sem descoloração no centro. Após alguns dias na solução RIMS à temperatura ambiente, o coração deve ser completamente limpo e alguma expansão tecidual pode ser observada.
Como observado pela expressão proteica tdTomato repórter, os nervos cardíacos são principalmente superficiais com algumas populações residentes na camada epicárida. É importante ressaltar que a confirmação da expressão proteica repórter é preservada após passar pelo protocolo de clareza, como demonstrado. Limpar e fotografar o coração 3D fornece perspectiva para a localização e morfologia das populações de células cardíacas.
Isso nos permite identificar novos aspectos na padronização celular e interações célula-célula.
