내인성 심장 재생은 강력한 재생 반응을 탑재하기 위해 함께 작업하는 여러 세포 유형을 포함하는 동적 과정입니다. 부상에 대한 응답으로 클리어 된 심장의 3D 이미징을 통해 재생 조직으로 피어링은이 심장 재생 반응을 안내하는 세포 역학의 재건에 도움이 될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 개발 및 재생 중에 세포를 추적하도록 특별히 설계되었습니다.
우리는 다른 장기 유형에 우리의 청산, 염색 및 화상 진찰 기술을 광범위하게 적용하는 데 아무런 제한이 없다고 예측합니다. LAD 유도 관상 동맥 폐색의 경우, 먼저 살균 된 1 일 된 신생아 새끼의 수술 부위를 살균하여 방부제 용액을 제공합니다. 가슴 부위에 횡단 피부 절개를 합니다.
피부와 근육을 분리하려면 드레싱 포셉을 사용하여 피부를 조심스럽게 들어 올리는 동시에 가위를 닫힌 자세로 늑간 근육에 부드럽게 누르십시오. 네 번째 늑간 공간을 찾아 작은 집게를 사용하여 내부 장기를 피하기 위해 작은 피상적 인 구멍을 처리합니다. 무딘 해부와 드레싱 집게를 사용하여, 손가락이 복부의 왼쪽에 적용 될 때까지 늑간 근육 사이의 영역을 넓히고 드레싱 집게로 늑간 공간을 열어 가슴 구멍에서 부드럽게 안내합니다.
심장이 추출되면 심장이 늑간 근육에 휴식을 취하여 풀이 덜 한 혈액을 가진 심장 영역으로 LAD를 찾도록 하십시오. 심근 경색을 유도하기 위해 6-0 봉합사를 사용하여 동맥을 끊지 않고 용기 주위에 사각형 매듭을 두 번 단단히 묶습니다. 정점에 희게 즉시 관찰해야합니다.
비슷한 경색 크기에 대 한 LAD를 따라 봉합사 배치에 일관성을 유지 하는 것이 중요 하다. 이것은 혈액이 아직도 동맥을 통해 흐르는 동안 심장에 빨리 접근하여 달성됩니다. 봉합사가 배치되면 심장이 가슴 구멍으로 다시 미끄러질 수 있습니다.
갈비뼈의 상부와 하부 세트를 통과하는 동안 갈비뼈의 상부 세트를 들어 올리는 무딘 집게를 사용하여 한 외과 의사와 한 평방 매듭과 함께 갈비뼈를 봉합합니다. 상복부에 소량의 피부 접착제를 바르고 미세 한 집게를 사용하여 노출 된 가슴 부위에 하복부의 피부를 배치하십시오. 그런 다음 강아지를 가열 패드에 놓고 다음 동물에 결찰을 수행합니다.
모든 수술이 수행되면 따뜻하고 이동식 새끼를 어머니의 집 케이지로 되돌려 놓습니다. 수확된 심장 조직의 수동적인 명확성을 위해, 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후 21일 수술 후, 마우스를 supine 위치에 있는 깨끗한 수술 부위에 놓고 테이프로 팔다리를 고정시하십시오. 조직 집게를 사용하여, xiphoid 과정 바로 아래에 모피를 잡고 흉곽의 폭에 걸쳐 절개를합니다.
흉곽의 말단 부분과 함께 잘라 횡격막을 노출하는 xiphoid 과정을 들어 올리기 위해 집게를 사용합니다. 다이어프램을 구부러진 집게로 분리하고 박동하는 심장이 접근 할 때까지 조직을 미친 듯이 당깁니다. 곡선 된 집게를 사용하여 베이스의 심장을 파악하고 iridectomy 가위를 사용하여 대오르타와 우수한 베나 카바를 자른다.
심장이 유지된 혈액을 펌핑할 수 있도록 박동하는 심장을 PBS의 페트리 접시에 넣습니다. 심근 경색은 LAD 결찰의 올바른 해부학적 배치에 의해 확인될 수 있다. 심장박동이 멈추면, 잔류 혈액을 추방하고 표본을 PBS 의 2 밀리리터를 포함하는 일회용 2.5 밀리리터 유리 껍질 바이알로 옮기기 위해 집게로 기관을 부드럽게 짜냅니다.
용액이 혈액이 제거될 때까지 10분마다 PBS 용액을 변경하는 실온에서 적어도 30분 동안 바이알을 셰이커에 놓습니다. PBS가 명확할 때 PBS를 실온에서 4시간 동안 잠복한 후 워시당 2밀리리터의 신선한 PBS2밀리리터로 셰이커에 10분 동안 세척할 수 있는 2밀리리터로 PBS를 교체하십시오. 마지막 세척 후, 4%의 아크릴아미드의 2밀리리터로 바이알을 채우고 섭씨 4도에서 하룻밤 잠복할 수 있도록 0.5%VA-044 용액을 보충합니다.
다음 날, 3 시간 동안 섭씨 37도 열 블록에 유리병을 배치합니다. 중합의 끝에서, 새로운 유리 껍질 유리 바이알로 심혼을 전송하고 모든 잠복의 끝에 PBS를 상쾌하게 한 번에 신선한 PBS 10 분의 2 밀리리터에 심장 조직을 씻어. PBS가 명확하면 세척 버퍼를 2밀리리터의 클리어링 솔루션으로 교체합니다.
심장이 맑을 때까지 몇 주 동안 섭씨 37도에서 표본을 배양하여 2~3일마다 클리어링 솔루션을 새로 고침합니다. 장기가 명확할 때, 37섭씨에서 24시간 배양을 위해 바이알을 신선한 PBS로 리필하기 전에 시연된 대로 셰이커에 PBS로 시편을 씻으시다. 다음 날, PBS를 RIMS로 교체하여 섭씨 37도에서 24시간 배양할 수 있습니다.
잠복이 끝나면 조직이 완전히 지워집니다. 조직은 몇 주 후에 투명해져야 합니다. 심근 경색 유도 후 삭제 된 산후 마우스 심장의 이미징을 위해 PBS와 맞춤형 우울증 슬라이드의 챔버의 절반을 채우고 곡선 된 집게를 사용하여 클리어 된 심장을 조심스럽게 챔버로 옮긴다.
PBS로 챔버의 나머지 볼륨을 채웁니다. 그런 다음 액체 표면이 챔버의 상단 위에 돔을 형성하고 표준 이미징 프로토콜에 따라 공초점 현미경에 의해 조직을 이미징하기 전에 커버 슬라이드를 장착 할 때까지 PBS로 챔버를 채웁니다. 천자와 무딘 해부는 흉골에 근접너무 가까이있는 경우, 심장은 가슴 구멍을 종료하지 못할 수 있습니다.
심장이 쉽게 구멍을 빠져나가지 않으면 왼쪽 복부에 압력을 가하여 과정을 용이하게 하십시오. 합병증은 늑간 근육에 심혼을 휴식에서 생길 수 있습니다. 따라서 LAD의 명확한 시각화 및 접근성을 허용하기 위해 무딘 해부를 수평 방향으로 최소한의 크기로 유지하는 것이 중요합니다.
피상적 결찰은 최종 봉합사 배치에서 조정할 여지가 적고 LAD 주변의 봉합사가 제어된 꾸준한 움직임으로 수행되어야 합니다. 클리어링 단계가 끝날 때까지 심장 전체가 중앙에 변색없이 일관되게 불투명해야합니다. 실온에서 RIMS 용액에서 며칠 후, 심장은 완전히 지워야하며 일부 조직 확장을 관찰 할 수 있습니다.
tdTomato 리포터 단백질 발현에 의해 관찰된 바와 같이, 심장 신경은 주로 상고층에 거주하는 일부 인구와 피상적이다. 중요한 것은, 리포터 단백질 발현 확인은 입증된 바와 같이 선명도 프로토콜을 받은 후에 보존된다. 3D 심장을 지우고 이미징하면 심장 세포 집단의 위치와 형태에 대한 관점을 제공합니다.
이것은 우리가 세포 패터닝 및 세포 세포 상호 작용에 있는 새로운 양상을 확인하는 것을 허용합니다.
