يتيح لنا هذا البروتوكول التحقيق في الدعامات التي تُلَلِّط المخدرات في نموذج حيواني صغير من تضيق الحنجرة مما يتيح لنا الاستفادة من الحيوانات المعدلة وراثياً بطريقة فعالة من حيث التكلفة. وضع عبر الطرق من دعامة مجرى الهواء الممسيل المخدرات تجنيب الحيوانات من شق مفتوح في القصبة الهوائية التي تمثل نموذجا أكثر أهمية سريريا من التضيق الحنجرة. هذه التقنية تسهل التحقيق قبل الإكلينيكي لاستراتيجيات توصيل الأدوية المحلية لعلاج تضيق الحنجرة.
توفر هذه التقنية منصة مجدية وفعالة للتحقيق في الدعامات الهوائية المائلة للمخدرات في نموذج حيواني صغير يمكن تطبيقه للتحقيق في النماذج الحيوانية الأكبر حجمًا بالإضافة إلى التطبيق السريري. تقنية خاصة في النوبات transtental، تحريض إصابة القصبة الهوائية، وخطوة وضع دعامة مجرى الهواء. عرض مرئي لهذه الجراحة الصعبة تقنيا أمر بالغ الأهمية لأن العديد من التفاصيل الدقيقة لا يمكن وصفها بشكل كامل في الكلمات.
لجعل 1٪ rapamycin التي تحتوي على حل البوليمر، إضافة ستة ملليغرام من راباميسين إلى 600 ملليغرام من 70-30 PLLA-PCL في قارورة زجاجية. تحت غطاء محرك الدخان، إضافة ستة ملليلتر من ديكلوروميثان إلى يباميسين تكمل والسيطرة على القارورة وإضافة 120 ميكرولترات من الجلسرين إلى كل قارورة. ثم قم بغطاء القنينات والسماح لحل PLLA-PCL لتجانس لمدة ست إلى 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
لإنشاء دعامة مجرى الهواء مورين، وذلك باستخدام المواد العقيمة والتقنية، وتطبيق ملليلتر واحد من راباميسين مكملة حل PLLA-PCL على كانية الوريد من 22 مقياس بروبيلين الاثيلين المفلورة القائمة على أنجيوكاثيرتر مع إبطاء تدوير القسطرة. عندما تم تطبيق كل من الحل، دعم angiocatheter مصبوب مع غيض من أنجيوكاثيتر التي تواجهها إلى أسفل وهُل القسطرة على حافة طبق بيتري الزجاج في غطاء محرك فراغ. بعد 24 ساعة تحت فراغ في درجة حرارة الغرفة، تطور بلطف وانزلاق القسطرة من بناء الدعامة المجففة والتحقق محيطا من الدعامة لأي عيوب قد تكون نتجت أثناء عملية الصب.
للمساعدة في التصور، فمن المفيد لرسم خط أسود رقيقة أسفل طول الدعامة. تقليم كل نهاية من الدعامات المصبوب مع مقص مستقيم غرامة بحيث حواف محورية واستخدام مقص لقطع كل دعامة إلى ثلاثة شرائح محورية ملليمتر. ثم تحميل كل دعامة ثلاثة ملليمترات على قسطرة وريدية قياس 22 جديدة.
لالتدسيس تضيق الحنجرة، بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القار، ضع الفأر الأول على منصة جراحية في موقف supine وحلقة قطعة صغيرة من الخيط الملصقة على الجزء العلوي من منصة حول القاطعات المركزية. تأمين أطرافه إلى الجدول مع الشريط وجعل 1.5 سنتيمتر في منتصف شق عمودي في عنق الماوس. تقسيم الغدة الصعترية المغالى فيها وفيما بعد فصين الناتجين لتصور القصبة الهوائية.
تقسيم عضلات sternohyoid وterrotheroid متفوق في المرفقات الثنائية العليا وتمرير 22 قياس أنجيوثيتر transorally من خلال الحنجرة في القصبة الهوائية. باستخدام ملقط صغيرة، وتطبيق الضغط على الحنجرة الأمامية للماوس للمساعدة في وضع الصحيح من القسطرة. يمكن تصور أنجيوكاثيتر وضعت بشكل صحيح من خلال لونها الأبيض من خلال القصبة الهوائية.
للحث على الإصابة ، تمرير فرشاة سلك Bleomycin المغلفة من خلال أنجيوكاثيتر المدرج وسحب ببطء القسطرة بحيث تبقى فرشاة الأسلاك فقط داخل القصبة الهوائية. باستخدام ملقط غرامة، وتطبيق مضاد للضغط على القصبة الهوائية لتعطيل ميكانيكيا لومن القصبة الهوائية مع فرشاة قبل إعادة إدخال القسطرة في القصبة الهوائية على الفرشاة. إزالة فرشاة الأسلاك وإعادة تطبيق Bleomycin قبل إدراج وإزالة الفرشاة أربع مرات أخرى كما أظهرت للتو.
بعد تطبيق بلوميسين الأخير، قم بإزالة القسطرة من القصبة الهوائية. بالنسبة لوضع عبراتنة من PLLA-PCL، تأكد من أن خط عمودي أسود رفيع قد تم دمجه في كل دعامة و إنبات الماوس مع أنجيوكاثيتر محملة مسبقاً. وينبغي تصور الدعامة داخل القصبة الهوائية من خلال شق عبر الإرسالية.
عندما تكون الدعامة في مكانها، استخدم ملقطًا ناعمًا لإدراك القصبة الهوائية بقوة ولكن بلطف من خلال الشق لعقد الدعامة في مكانها وإزالة القسطرة. من المهم وضع الدعامة بعناية قدر الإمكان. الكثير من الضغط على القصبة الهوائية سيؤدي إلى انهيار الدعامة مما تسبب في انسداد مجرى الهواء والموت للحيوان.
إغلاق شق مع الغراء الأنسجة أو امتصاص 4-0 الغرز الكرومية المستخدمة هنا والسماح للماوس لاسترداد مع الرصد قبل العودة إلى قفص الحيوان المنزل. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، ضع فأر الاهتمام في موضع الوبين على المنصة الجراحية واستخدم مقص قزحية منحنية منحني ناعم لإعادة فتح الشق. كشف القصبة الهوائية كما أظهرت واستخدام مقص لتقسيم القصبة الهوائية القعرية تحت مستوى الدعامة.
بعد ذلك، قم بتقسيم القصبة الهوائية القريبة أسفل الحنجرة وفوق الدعامة وفصل القصبة الهوائية المقسمة عن المريء بشكلٍ مُتَمَرَّح. ثم إزالة الدعامة من القصبة الهوائية وإصلاح القصبة الهوائية في 10٪ formalin لمدة 24 ساعة. إن الرامايسايسين القابل للتحلل الحيوي الذي تم تحميله ببناء الدعامات PLLA-PCL المستخدم في هذه الدراسة قادر على تضخيم راباميسين بطريقة متسقة ويمكن التنبؤ بها في ظل الظروف الفسيولوجية.
في هذه الصورة، يمكن ملاحظة الدعامة المصغرة القابلة للالتقاء بيولوجياً في موضعها داخل القصبة الهوائية كما هو مبين من خلال العلامة السوداء على الدعامة التي تصور من خلال القصبة الهوائية الماوس الشفافة. بعد 21 يوما، يمكن استخدام علامة الصبغة السوداء لتأكيد الحفاظ على موقف الدعامة داخل القصبة الهوائية. اختبار التوافق الحيوي باستخدام تلطيخ مناعي لعلامات الالتهاب الحاد والمزمن تثبت أن بناء الدعامات PLLA-PCL ليست نشطة مناعية كما يحددها العدد الأدنى من الخلايا المناعية الموجودة بعد وضع في غياب الإصابة.
التلاعب بالمجرى الهوائي بطريقة حساسة وعصرية أمر بالغ الأهمية لنجاح الإجراء. القوة المفرطة، النوبات المتعددة، وانهيار الدعامات يمكن أن تؤدي إلى موت الحيوانات. بعد العلاج مع الدعامة راباميسين eluting, تقييم البقاء على قيد الحياة, التعبير الجيني عن طريق الكم في الوقت الحقيقي PCR, المناعة بما في ذلك تدفق استئصال الدم, ELISA, ويمكن إجراء الكيمياء المناعية.
كما أنه يوفر منصة ناجحة للتغذية الدوائية في نموذج الماوس، وهذه التقنية يمهد الطريق للتحقيقات المستقبلية للعلاجات المطبقة محليا في التضيق الحنجرة. ثنائي كلورو الميثان هو سائل متآكل. تأكد من استخدام غطاء الدخان دائمًا، ومعدات الحماية الشخصية، والمواد غير المسببة للتآكل
