Questo protocollo ci consente di studiare gli stent che eluiscono i farmaci in un piccolo modello animale di stenosi laringotracheale che ci consente di sfruttare gli animali geneticamente modificati in modo conveniente. Il posizionamento transorale dello stent delle vie aeree che eluisce il farmaco risparmia gli animali da un'incisione aperta nella trachea che rappresenta un modello più clinicamente rilevante di stenosi laringotracheale. Questa tecnica facilita l'indagine preclinica delle strategie locali di somministrazione dei farmaci per il trattamento della stenosi laringolaretracheale.
Questa tecnica fornisce una piattaforma fattibile ed efficace per l'indagine traslizionale di stent delle vie aeree che eluiranno farmaci in un piccolo modello animale che possono essere applicati per future indagini su modelli animali più grandi e applicazioni cliniche. intubazione transorale, induzione di lesioni da trachea e fase di posizionamento dello stent delle vie aeree. La dimostrazione visiva di questo intervento chirurgico tecnicamente impegnativo è fondamentale in quanto molti dei dettagli non possono essere descritti completamente a parole.
Per creare una soluzione polimerica contenente 1%rapamicina, aggiungere sei milligrammi di rapamicina a 600 milligrammi di 70-30 PLLA-PCL in una fiala di vetro. Sotto una cappa aspirante aggiungere sei millilitri di diclorometano alla rapamicina integrata e controllare la fiala e aggiungere 120 microlitri di glicerolo ad ogni flaconcino. Quindi limitare le fiale e consentire alla soluzione PLLA-PCL di omogeneizzare per sei-12 ore a temperatura ambiente.
Per creare uno stent di vie aeree murine, utilizzando materiali e tecniche sterili, applicare un millilitro di rapamicina integrata soluzione PLLA-PCL sulla cannula venosa di un angiocatetere a base di propilene fluorurato calibro 22 mentre rallenta la rotazione del catetere. Una volta applicata tutta la soluzione, puntellare l'angiocatetere modellato con la punta dell'angiocatetere rivolta verso il basso e l'elsa del catetere sul bordo di una piastra di Petri di vetro in un cappuccio sottovuoto. Dopo 24 ore sotto vuoto a temperatura ambiente, torcere delicatamente e far scorrere il catetere dal costrutto dello stent essiccato e controllare circonferenzialmente lo stent per eventuali difetti che potrebbero aver provocato durante il processo di colata.
Per aiutare nella visualizzazione, è utile disegnare una sottile linea nera lungo la lunghezza dello stent. Tagliare ogni estremità degli stent fusi con forbici dritte fini in modo che i bordi siano assiali e utilizzare le forbici per tagliare ogni stent in tre segmenti assiali millimetri. Quindi caricare ogni tre millimetri stent su un nuovo catetere venoso calibro 22.
Per l'induzione della stenosi laringotracheale, dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, posizionare il primo mouse su una piattaforma chirurgica in posizione supina e far scorrere un piccolo pezzo di filo apposto sulla parte superiore della piattaforma attorno agli incisivi centrali. Fissare gli arti al tavolo con nastro adesivo e fare un'incisione verticale della linea mediana di 1,5 centimetri nel collo del mouse. Dividere il timo sovrascritta e lateralizzare i due lobi risultanti per visualizzare la trachea.
Dividere i muscoli sternoioide e sternotiroidi sovrastanti all'attacco superiore bilateralmente e passare un angiocatetere calibro 22 trasorally attraverso la laringe nella trachea. Utilizzando piccole forcep, applicare pressione sulla laringe anteriore del mouse per aiutare nel corretto posizionamento del catetere. Un angiocatetere correttamente posizionato può essere visualizzato dal suo colore bianco attraverso la trachea.
Per indurre la lesione, passare una spazzola metallica rivestita di bleomicina attraverso l'angiocatetere inserito e ritirare lentamente il catetere in modo che rimanga solo la spazzola metallica all'interno della trachea. Utilizzando forcep fini, applicare la contropressione sulla trachea per interrompere meccanicamente il lume tracheale con il pennello prima di reinserire il catetere nella trachea sopra la spazzola. Rimuovere il pennello a filo e riapplicare la Bleomicina prima di inserire e rimuovere il pennello altre quattro volte come appena dimostrato.
Dopo l'ultima applicazione di bleomicina, rimuovere il catetere dalla trachea. Per il posizionamento transorale di un PLLA-PCL, assicurarsi che una sottile linea verticale nera sia stata incorporata in ogni stent e intubare transorally il mouse con l'angiocatetere precaricato. Lo stent deve essere visualizzato all'interno della trachea attraverso l'incisione transcervicale.
Quando lo stent è in posizione, utilizzare le forcep fini per afferrare saldamente ma delicatamente la trachea attraverso l'incisione per tenere lo stent in posizione e rimuovere il catetere. È fondamentale posizionare lo stent nel modo più attento possibile. Troppa pressione sulla trachea comporterà il collasso dello stent causando ostruzione delle vie aeree e morte all'animale.
Chiudere l'incisione con colla tissutale o suture cromatiche 4-0 assorbibili utilizzate qui e consentire al topo di riprendersi con il monitoraggio prima di riportare l'animale nella sua gabbia domestica. All'endpoint sperimentale appropriato, posizionare il mouse di interesse nella posizione supina sulla piattaforma chirurgica e utilizzare forbici dell'iride curve fini per riaprire l'incisione. Esporre la trachea come dimostrato e utilizzare le forbici per dividere la trachea distale al di sotto del livello dello stent.
Successivamente, dividere la trachea prossimale sotto la laringe e sopra lo stent e separare la trachea divisa dall'esofago posteriormente. Quindi rimuovere lo stent dalla trachea e fissare la trachea in formalina al 10% per 24 ore. Il costrutto di stent PLLA-PCL caricato con rapamicina biodegradabile utilizzato in questo studio è in grado di eluire la rapamicina in modo coerente e prevedibile in condizioni fisiologiche.
In questa immagine, lo stent biocompatibile miniaturizzato può essere osservato in situ all'interno della trachea come indicato dal marcatore nero sullo stent visualizzato attraverso la trachea traslucida del mouse. Dopo 21 giorni, il marcatore di colorante nero può essere utilizzato per confermare il mantenimento della posizione dello stent all'interno della trachea. I test di biocompatibilità che utilizzano colorazione immunofluorescente per marcatori di infiammazione acuta e cronica dimostrano che il costrutto stent PLLA-PCL non è immunoreattivo come determinato dal numero minimo di cellule immunitarie presenti dopo il posizionamento in assenza di lesioni.
Manipolare le vie aeree in modo delicato e atraumatico è fondamentale per il successo della procedura. La forza eccessiva, le intubazioni multiple e il collasso dello stent possono portare alla morte animale. Dopo il trattamento con stent di eluizione della rapamicina, è possibile eseguire la valutazione della sopravvivenza, l'espressione genica tramite PCR quantitativa in tempo reale, l'immunoanalisi tra cui citometria del flusso, ELISA e immunoistochimica.
Poiché fornisce una piattaforma di successo per l'eluizione dei farmaci in un modello di topo, questa tecnica apre la strada a future indagini di terapie applicate localmente nella stenosi laringotracheale. Il diclorometano è un liquido corrosivo. Assicurarsi di utilizzare sempre una cappa aspirante, dispositivi di protezione individuale e materiali non corrosivi
