البروتوكول التالي يوفر تعليمات لتوليد الخلايا الجذعية الذاتية التي يسببها الإنسان متعددة القدرات من خلال إعادة برمجة سريعة وفعالة من الخلايا الليفية الجلدية البشرية المعزولة من خزعة لكمة الجلد. الإجراءات يمكن أن تنفذ من قبل الباحثين مع خبرة ضئيلة أو معدومة في إعادة برمجة الخلايا ومع التكيف السليم، ويسمح نتاج الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالخلايا المتعددة القدرات غير المستحثة بـ xeno. يمكن استخدام خلايا IPS الذاتية لتطبيقات الطب التجديدي والنمذجة لأمراض مثل الاضطرابات الوراثية أو السرطان للتحقيق في الآليات الجزيئية الأساسية وتطوير علاجات أكثر تحديدًا.
فعبء العمل مرتفع. ومن المفيد للغاية دراسة البروتوكول قبل التخطيط بعناية للتجربة، بما في ذلك الخطوات التي ينبغي خلالها إعداد الكواشف والمواد. إن العرض المرئي للإجراء يساعد الأبحاث ذات الخبرة الضئيلة أو التي لا تقوم بعزل الخلية وإعادة البرمجة، وتجنب الأخطاء الشائعة المتعلقة بالتلوث الميكروبي والRNA المحتمل.
تحت غطاء معقمة، قم بغسل عينة الجلد البشري التي تم الحصول عليها حديثًا من البطن في طبق 100 ملليمتر مع حل HPSS. إزالة الشعر والدهون باستخدام ملقط ناعم ومقص وتشريحه بمشرط للحصول على شظايا من حجم مليمترين في ملليمتر واحد، وتجنب الندوب، والمناطق القذرة أو المحروقة من الأنسجة. ضع أربع أجزاء صغيرة في كل طبق 35 ملليمتر، غطيه بزجاج معقمة وضيف 1.5 ملليمتر من I-DMEM.
احتضان لوحات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لحوالي 15 يوما أو حتى تصل الخلايا التقاء 85٪. تغيير ثقافة المتوسطة كل ثلاثة أيام والتحقق من نمو الخلايا باستخدام المجهر النقيض المرحلة المقلوب يوميا. الآن، رفع الغطاء النظارات مع ملقط غرامة، ووضعها رأسا على عقب في طبق 100 ملليمتر وغسل مع 1X برنامج تلفزيوني معقمة.
إزالة أجزاء من العينات وتجاهلها. اغسل الأطباق مع 1X PBS العقيمة. إزالة برنامج تلفزيوني 1X وإضافة ثلاثة ملليمترات من تريبسين-EDTA إلى النظارات غطاء وضعت في طبق 100 ملليمتر وإضافة ملليمتر واحد من تريبسين-EDTA إلى 35 ملليمتر أطباق كذلك.
احتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم، كتلة التربسينية عن طريق إضافة خمسة ملليمترات من TSS إلى طبق 100 ملليمتر واثنين من ملليمترات من TSS إلى كل طبق 35 ملليمتر. جمع تعليق في أنابيب معقم 15 ملليمتر، الطرد المركزي في 400 مرة G في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
التعرق وssuspend بيليه في 12 ملليمتر من I-DMEM. تقسيم تعليق الخلية إلى ثلاثة ملليمتر aliquots ونقل كل منها في لوحة 60 ملليمتر. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
تغيير المتوسط يوميا. إبقاء الخلايا في الثقافة حتى تصل إلى التقاء 75٪ بعد ذلك، كرر التربسيناتية ثلاث مرات للحصول على الخلايا التي مرور أربعة. ثم مزامنة الخلايا عن طريق استبدال I-DMEM مع S-DMEM واحتضان لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
أثناء تزامن الخلية، وإعداد توسيع الخلايا الليفية المتوسطة ومجموع غير معدلة رنا إعادة برمجة كوكتيل للبرمجة الحرة الليفية. لتبسيط إعداد الأنابيب التسعة من aliquots الحمض النووي الريبي غير المعدلة التي يتم تقسيمها بعد ذلك إلى 36 ، اعتدنا على اتباع مخطط نعلقه على جدار غطاء محرك السيارة. معطف لوحة 24-جيدا عن طريق نقل 100 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي ذاب على الجليد إلى كل بئر لتغطية بشكل موحد القاع.
احتضان لمدة ساعة واحدة على الأقل في 37 درجة مئوية قبل بذر الخلايا. pirate المتوسطة من لوحات مع الخلايا في الثقافة وغسل بسرعة في 1X PBS. كرر التبسينيم للحصول على الخلايا التي مرور خمسة.
التعرق وssuspend بيليه في حجم مناسب من الليفية التوسع المتوسطة. تحضير وتنظيف جهاز قياس الهيموسيت مع 70٪ من الكحول. ثم، إعداد حل عن طريق خلط بلطف 10 ميكرولترات من الأزرق trypan و 10 ميكرولترات من تعليق الخلية في أنبوب 1.5 ملليلتر، واحتضان لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
ماصة 10 ميكرولترات من الحل في قياس الهيموسيت ووضعها على خشبة المسرح من المجهر النقيض المرحلة المقلوبة لحساب. الخلايا غير القابلة للحياة زرقاء بينما الخلايا القابلة للحياة غير مُطَرَّقة. عد الخلايا في مربعين على الأقل من غرفة قياس الهيموسيت.
تنفيذ التخفيف للحصول على كثافة 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الرابعة لكل 500 ميكرولترات من الليفي توسيع المتوسطة و resuspend بيليه الخلية. ماصة 500 ميكرولترات من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة 24-جيدا. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في الصباح، وإزالة المتوسطة القديمة من كل بئر واستبدالها مع 500 ميكرولترات من قبل زارميد xeno خالية من عامل خالية من الثقافة المتوسطة. احتضان في 37٪ درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات على الأقل. ذوبان خمسة 15.4 ميكرولتر aliquots من مجموع nmrna إعادة برمجة كوكتيل في درجة حرارة الغرفة ثم وضعها في الجليد.
إضافة 234.6 ميكرولترات من متوسطة المصل مخفضة لكل aliquot، ماصة بلطف ثلاث إلى خمس مرات وتسمية كل واحد كما أنبوب A.Label خمسة مواسير معقمة خالية من 0.5 ملليلتر أنابيب كما أنبوب B ومزيج ستة ميكرولترات من الاصطناعية الصغيرة تتدخل RNA reafection مع 244 ميكرولتر من متوسطة المصل مخفضة. ثم، واستخدام الماصات لإضافة محتويات كل أنبوب B إلى أنبوب قطرة الحكمة. مزيج عن طريق التنصت على الجزء السفلي من الأنبوب.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، لإضافة 125 ميكرولترات من nmRNA حل معقدة نقل من كل من aliquots الخمسة إلى كل بئر، إمالة لوحة والماصات قطرة الحكمة في الوسط. اخلط المحتويات في الآبار العشرين عن طريق الهزاز بلطف.
استخدم الآبار الأربعة المتبقية كمرجع. احتضان لوحة لمدة 15 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، استلهم الوسط.
تحت غطاء محرك السيارة العقيمة، كرر إجراء transfection، كما في اليوم الأول، كل يوم لمدة ثلاثة أيام أخرى. في اليوم الخامس، استلهم الوسط وتبادله مع سيارة XF/FF ثقافة متوسطة طازجة ومدفأة مسبقًا تحت غطاء معقمة. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
مراقبة ثقافة الخلية يوميا عن طريق المجهر النقيض مرحلة، حتى مراقبة تشكيل مستعمرات IPSC. وكان الهدف من هذا البروتوكول لإعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية المعزولة من جلد البطن باستخدام طريقة إعادة البرمجة غير المتكاملة. تفوقت الخلايا الليفية البشرية من عينات من جلد البطن في غضون أسبوع واحد من الثقافة ووصلت إلى التقاء 85٪في غضون أسبوعين.
تميزت الخلايا بنمو لاصق على أطباق الثقافة البلاستيكية ، وتنوعت مورفولوجياها من ممدود ومغزل الشكل إلى مسطح وشكل نجمة. الليفية مورفولوجيا والترتيب والثقافة تغيرت بشكل كبير بعد البذر على BMM، عندما اكتسبوا مورفولوجيا ممدود ورتبت لتشكيل هياكل متفرعة رقيقة. كانت المستعمرات الصغيرة مرئية بالفعل في الثقافة في اليوم الأول من مرحلة النقل الأولى ونما حجمها تدريجياً بمرور الوقت، في حين زاد عددها حتى اليوم السابع ثم ظلت مستقرة بين اليوم السابع واليوم 14، ربما نتيجة اندماج المستعمرات الأصغر لتشكيل مستعمرات أكبر.
وبما أن إجراء إعادة البرمجة قد تم باستخدام وسائل الإعلام الخالية من المضادات الحيوية، في حالة عدم ضمان الظروف العقيمة، أصبح التلوث الميكروبي قضية رئيسية. ويؤثر معدل الانتشار وكثافة الطلاء على كفاءة إعادة البرمجة، لذا من المهم تخطيط عملية تمرير الخلايا وتحديد كثافة الطلاء على أساس معدل انتشار الخلايا. استبدال الكواشف المشتقة من الحيوانات للكاشف المناسبة خالية من xeno ، وهذا البروتوكول يسمح بإعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية البالغة في خلايا IPS في بيئة ثقافة خالية من xeno كاملة لم تكن استخدامها السريري.
الخلايا البشرية هي مصدر محتمل للعدوى بمسببات الأمراض المنقولة بالدم ، وبالتالي ، يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية طوال العملية.
