Das folgende Protokoll enthält Anweisungen zur Erzeugung autologer, vom Menschen verursachter pluripotenter Stammzellen durch die schnelle und effiziente Umprogrammierung menschlicher dermaler Fibroblasten, die aus einer Hautschlagbiopsie isoliert sind. Die Verfahren können von Forschern mit wenig oder gar keiner Erfahrung in der Zellreprogrammierung durchgeführt werden und mit der richtigen Einstellung, ermöglicht das Produkt von xeno-freien induzierten pluripotenten Stammzellen. Autologe IPS-Zellen könnten für anwendungen in der regenerativen Medizin und zur Modellierung von Krankheiten wie genetischen Störungen oder Krebs verwendet werden, um zugrunde liegende molekulare Mechanismen zu untersuchen und spezifischere Therapien zu entwickeln.
Die Arbeitsbelastung ist hoch. Es ist äußerst hilfreich, das Protokoll zu studieren, bevor das Experiment sorgfältig geplant wird, einschließlich der Schritte, in denen Reagenzien und Materialien vorbereitet werden sollten. Die visuelle Demonstration des Verfahrens hilft den Forschern mit wenig oder gar keiner Erfahrung, die Zellisolierung und die Neuprogrammierung durchzuführen und häufige Fehler im Zusammenhang mit einer möglichen mikrobiellen und RNA-Kontamination zu vermeiden.
Unter einer sterilen Kapuze die frisch erhaltene Probe der menschlichen Haut aus dem Bauch in einer 100-Millimeter-Schale mit HPSS-Lösung waschen. Entfernen Sie Haare und Fett mit feinen Zangen und Scheren und sezieren Sie es mit einem Skalpell, um Fragmente von der Größe von zwei Millimetern um einen Millimeter zu erhalten, Narben, schmutzige oder verbrannte Bereiche des Gewebes zu vermeiden. Legen Sie vier kleine Fragmente in jede 35-Millimeter-Schale, decken Sie mit einem sterilen Deckglas und fügen Sie 1,5 Millimeter I-DMEM.
Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für etwa 15 Tage oder bis die Zellen 85% Zusammenfluss erreichen. Ändern Sie das Kulturmedium alle drei Tage und überprüfen Sie täglich das Auswuchs von Zellen mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop. Heben Sie nun die Deckgläser mit feiner Zange an, legen Sie sie auf den Kopf in eine 100-Millimeter-Schale und waschen Sie sie mit 1x sterilem PBS.
Entfernen Sie die Fragmente der Proben, und entsorgen Sie sie. Waschplatten mit 1x sterilem PBS. Entfernen Sie die 1X PBS und fügen Sie drei Millimeter Trypsin-EDTA zu den Deckgläsern hinzu, die in der 100-Millimeter-Schale platziert sind, und fügen Sie den 35-Millimeter-Gerichten ebenfalls einen Millimeter Trypsin-EDTA hinzu.
Fünf Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren. Blockieren Sie dann die Trypsinisierung, indem Sie der 100-Millimeter-Schale fünf Millimeter TSS und jeder 35-Millimeter-Schale zwei Millimeter TSS hinzufügen. Sammeln Sie die Suspension in 15 Millimeter sterile Rohre, Zentrifuge bei 400 mal G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 12 Millimetern I-DMEM wieder auf. Teilen Sie die Zellaufhängung in drei Millimeter Aliquots auf und übertragen Sie sie jeweils in eine 60-Millimeter-Platte. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Ändern Sie das Medium täglich. Halten Sie Zellen in kultur, bis sie einen Zusammenfluss von 75% erreichen. Danach wiederholen Sie die Trypsinisierung dreimal, um Zellen zu erhalten, die durch vier Gehen. Synchronisieren Sie dann die Zellen, indem Sie das I-DMEM durch S-DMEM ersetzen und 48 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid brüten.
Bereiten Sie während der Zellsynchronisation einen Fibroblasten-Expansionsmedium und einen vollständigen nicht modifizierten RNA-Reprogrammierungscocktail für die fibroblastfreie Programmierung vor. Um die Herstellung der neun Röhren nicht modifizierter RNA-Aliquots zu vereinfachen, die dann in 36 aufgeteilt werden, folgten wir einem Schema, das wir an der Kapuzenwand befestigten. Mantel Sie eine 24-Well-Platte, indem Sie 100 Mikroliter Kellermembranmatrix auf Eis aufgetaut zu jedem Brunnen übertragen, um den Boden gleichmäßig zu bedecken.
Mindestens eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren, bevor die Zellen gesät werden. Aspirieren Sie das Medium von Platten mit Zellen in Kultur und waschen Sie schnell in 1X PBS. Wiederholen Sie die Trypsinisierung, um Zellen zu erhalten, die durch fünf Abschnitt sind.
Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem geeigneten Volumen von Fibroblasten-Ausdehnungsmedium aus. Vorbereiten und reinigen Sie das Hämozytometer mit 70% Alkohol. Dann bereiten Sie eine Lösung vor, indem Sie 10 Mikroliter Trypanblau und 10 Mikroliter Zellsuspension in einem 1,5-Milliliter-Rohr sanft mischen und ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
10 Mikroliter der Lösung in das Hämozytometer geben und auf die Bühne eines invertierten Phasenkontrastmikroskops legen, um es zu zählen. Nicht lebensfähige Zellen sind blau, während lebensfähige Zellen unbefleckt sind. Zählen Sie die Zellen in mindestens zwei Quadrate der Hämozytometerkammer.
Führen Sie eine Verdünnung durch, um eine Dichte von 2,5 mal 10 bis zu den vierten Zellen pro 500 Mikroliter Fibroblasten-Expansionsmedium zu erhalten und das Zellpellet wieder aufzusetzen. Pipette 500 Mikroliter der Zellsuspension in jeden Brunnen der 24-Well-Platte. Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Am Morgen das alte Medium aus jedem Brunnen entfernen und durch 500 Mikroliter vorgewelltes xenofreies faktorfreies Kulturmedium ersetzen. Inkubieren Sie bei 37%Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid für mindestens sechs Stunden. Fünf 15,4 Mikroliter Aliquots des gesamten nmRNA-Reprogrammierungscocktails bei Raumtemperatur auftauen und dann in Eis stellen.
Fügen Sie 234,6 Mikroliter reduziertes Serummedium zu jedem Aliquot hinzu, pipettedrei- bis fünfmal sanft pipette und beschriften Sie jede als Tube A.Label fünf sterile RNase-freie 0,5-Milliliter-Röhren als Tube B und mischen Sie sechs Mikroliter synthetisches, leicht störendes RNA-Transfektionsreagenz mit 244 Mikroliter reduziertem Serummedium. Dann verwenden Sie Pipetten, um den Inhalt jedes Rohres B zu einem Rohr a Tropfen weise hinzuzufügen. Mischen Sie, indem Sie auf den Boden des Rohres tippen.
15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach, um 125 Mikroliter nmRNA Transfektion komplexe Lösung aus jedem der fünf Aliquots zu jedem Brunnen hinzufügen, kippen Sie die Platte und Pipette fallen weise in das Medium. Mischen Sie den Inhalt in den 20 Brunnen, indem Sie sanft schaukeln.
Verwenden Sie die restlichen vier Brunnen als Referenz. Inkubieren Sie die Platte für 15 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag, aspirieren Sie das Medium.
Unter der sterilen Haube, wiederholen Sie die Transfektion, wie am ersten Tag, jeden Tag für drei weitere Tage. Am fünften Tag das Medium ansaugen und mit frischem, vorgewärmten XF/FF Culture Medium unter einer sterilen Haube austauschen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Überwachen Sie die Zellkultur täglich mit einem Phasenkontrastmikroskop, bis sie die Bildung von IPSC-Kolonien beobachtet. Das Ziel dieses Protokolls war es, dermale Fibroblasten, die von der Bauchhaut isoliert wurden, mit einer nicht-integrierenden Reprogrammierungsmethode neu zu programmieren. Menschliche Fibroblasten überstiegen innerhalb einer Woche kulturdurchproben Proben der Bauchhaut und erreichten innerhalb von zwei Wochen einen Zusammenfluss von 85 %.
Die Zellen waren durch das Klebstoffwachstum auf Kunststoffkulturgeschirr gekennzeichnet, und ihre Morphologie variierte von langgestreckt und spindelförmig bis abgeflacht und sternförmig. Fibroblastenmorphologie und Anordnung und Kultur änderten sich dramatisch nach der Aussaat auf BMM, als sie eine langgestreckte Morphologie erwarben und zu dünnen verzweigten Strukturen arrangierten. Kleine Kolonien waren bereits am ersten Tag der ersten Transfektion in der Kultur sichtbar und ihre Größe wuchs im Laufe der Zeit allmählich an, während ihre Zahl bis zum siebten Tag anwuchs und dann zwischen Tag sieben und Tag 14 stabil blieb, wahrscheinlich als Folge kleinerer Kolonien, die sich zu größeren Kolonien zusammenfanden.
Da das Umprogrammierungsverfahren mit antibiotikafreien Medien durchgeführt wurde, wurde in dem Fall, in dem sterile Bedingungen nicht garantiert waren, die mikrobielle Kontamination zu einem großen Problem. Proliferationsrate und die Beschichtungsdichte wirken sich auf die Reprogrammierungseffizienz aus, daher ist es wichtig, die Zelldurchblutung zu planen und die Beschichtungsdichte auf der Grundlage der Zellproliferationsrate zu definieren. Dieses Protokoll ersetzt tierische Reagenzien für geeignete xenofreie Reagenzien und ermöglicht die Umprogrammierung von erwachsenen menschlichen Fibroblasten in IPS-Zellen in einer kompletten xenofreien Kulturumgebung, die nicht ihre klinische Verwendung waren.
Menschliche Zellen sind eine potenzielle Infektionsquelle mit blutübertragenen Krankheitserregern, daher sollte persönliche Schutzausrüstung während des gesamten Verfahrens getragen werden.
