다음 프로토콜은 피부 펀치 생검으로부터 분리된 인간 진피 섬유아세포의 빠르고 효율적인 재프로그래밍을 통해 자가 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 지침을 제공합니다. 절차는 세포 재프로그래밍에 있는 거의 또는 전혀 경험이 없는 연구원에 의해 수행될 수 있고 적당한 조정으로, xeno 자유로운 유도한 만능 줄기 세포의 제품을 허용합니다. 자가 IPS 세포는 재생 의학 응용 프로그램을 위해 그리고 근본적인 분자 기계장치에 조사하고 더 특정 한 치료를 개발하기 위하여 유전 무질서 또는 암 같이 질병을 모델링하기 위하여 이용될 수 있습니다.
워크로드가 높습니다. 시약 및 재료가 준비되어야하는 단계를 포함하여 실험을 신중하게 계획하기 전에 프로토콜을 연구하는 것이 매우 유용합니다. 절차의 시각적 데모는 거의 또는 전혀 경험이없는 연구가 가능한 미생물 및 RNA 오염과 관련된 일반적인 실수를 피하면서 세포 격리 및 재프로그래밍을 수행하는 데 도움이됩니다.
멸균 후드 아래에서 HPSS 용액으로 100mm 접시에 복부에서 갓 얻은 인간의 피부 샘플을 씻어 내보라고 합니다. 미세 한 집게와 가위를 사용하여 머리와 지방을 제거하고 1 밀리미터에 의해 2 밀리미터크기의 조각을 얻기 위해 메스로 해부, 흉터를 피하기, 더러운 또는 조직의 연소 영역. 각 35mm 접시에 4개의 작은 조각을 놓고 멸균 커버 유리로 덮고 1.5밀리미터의 I-DMEM을 추가합니다.
약 15일 동안 또는 세포가 85%에 도달할 때까지 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 배양 배지를 3일마다 변경하고 매일 반전된 상 대비 현미경을 사용하여 세포의 성장을 확인한다. 이제 커버 안경을 미세한 집게로 들어 올리고 100mm 접시에 거꾸로 놓고 멸균 PBS 1X로 씻어 내보실 수 있습니다.
샘플의 조각을 제거하고 폐기합니다. 1X 멸균 PBS로 접시를 씻으시면 됩니다. 1X PBS를 제거하고 100mm 접시에 놓인 커버 안경에 트립신-EDTA 3밀리미터를 추가하고 트립신-EDTA 1mm를 35mm 요리에 추가합니다.
이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다. 그런 다음 각 35mm 접시에 100밀리미터 접시에 5mm의 TSS와 2밀리미터의 TSS를 추가하여 트립시니화를 차단합니다. 서스펜션을 15mm 멸균 튜브로 모으고, 원심분리기는 섭씨 4도에서 5분간 400배G로 수집합니다.
상류체를 흡인하고 I-DMEM의 12 밀리미터에서 펠릿을 재놓습니다. 세포 현탁액을 3mm 알리쿼트로 분할하고 각각 60mm 플레이트로 옮기습니다. 이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 배양합니다.
매일 매체를 변경합니다. 그 후에 75%의 합류에 도달할 때까지 배양에 세포를 유지, 4를 통과하는 세포를 얻기 위하여 트립시화를 세 번 반복합니다. 그런 다음 I-DMEM을 S-DMEM으로 대체하여 세포를 동기화하고 37도에서 48시간 동안 이산화탄소를 5%로 배양합니다.
세포 동기화 동안 섬유아세포 팽창 배지및 섬유아세포 무료 프로그래밍을 위한 총 비수정 RNA 리프로그래밍 칵테일을 준비합니다. 그 때 36으로 분할되는 비수정 RNA 알리쿼트의 9개의 튜브의 준비를 단순화하기 위하여, 우리는 우리가 후드 벽에 붙어 있는 계획을 따르기 위하여 이용했습니다. 24웰 플레이트를 얼음 위에 해동한 지하 멤브레인 매트릭스 100마이크로리터를 균일하게 바닥으로 덮어 줍니다.
세포를 파종하기 전에 섭씨 37도에서 적어도 한 시간 동안 배양하십시오. 배양세포로 플레이트에서 배지를 흡인하고 1X PBS로 빠르게 세척합니다. 트립시니화를 반복하여 5를 통과하는 세포를 얻습니다.
슈퍼나탈을 흡인시키고 섬유아세포 팽창 배지의 적절한 부피로 펠릿을 재보종한다. 70%의 알코올로 혈종계를 준비하고 청소하십시오. 그런 다음 1.5 밀리리터 튜브에 트라이판 블루 10 마이크로리터와 셀 서스펜션 10 마이크로리터를 부드럽게 혼합하고 실온에서 1~2분 동안 배양하여 용액을 준비합니다.
용액의 파이펫 10 마이크로리터는 용혈계로 들어가 서카운트하는 반전된 상 대비 현미경의 단계에 놓는다. 실행 가능한 세포가 얼룩지지 않는 동안 실행 불가능한 세포는 파란색입니다. 혈전계 챔버의 적어도 두 제곱에서 세포를 계산합니다.
섬유아세포 팽창 배지의 500 마이크로리터당 제4 세포에 2.5배 10배의 밀도를 얻고 세포 펠릿을 재보종한다. 파이펫 500 마이크로리터는 24웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액을 넣습니다. 하룻밤 동안 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.
아침에는 각 우물에서 오래된 매체를 제거하고 500 마이크로리터의 사전 zino-free 요인 없는 배양 매체로 대체하십시오. 최소 6시간 동안 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37%에서 배양합니다. 실온에서 총 nmRNA 리프로그래밍 칵테일의 5 15.4 마이크로 리터 알리 쿼트 다음 얼음에 배치.
각 알리쿼트에 234.6 마이크로리터를 첨가하고, 3~5회 부드럽게 파이펫을 만들고, 튜브 A.Label 5개의 멸균 RNase-free 0.5 밀리리터 튜브로 라벨을 붙이고, 합성 소형 간섭 RNA 트랜스퍼시약 6개에 244마이크로리터의 감속미미를 혼합한다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 각 튜브 B의 내용을 튜브 A 드롭에 현명하게 추가합니다. 튜브의 바닥을 눌러 섞는다.
실온에서 15분 동안 배양하세요. 그 후, 5개의 알리쿼트의 각에서 nmRNA 경질 복합용액125마이크로리터를 각각 양호하게, 플레이트와 파이펫 드롭을 배지로 현명하게 기울인다. 20 개의 우물에서 부드럽게 흔들어 내용내용을 섞습니다.
나머지 4개의 우물을 참조로 사용합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 15시간 동안 배양합니다. 다음 날, 매체를 흡인.
멸균 후드 아래에서, 3 일 동안 매일, 첫날과 같이, 형질 수술을 반복합니다. 5일째에는 중형을 흡기하고 멸균 후드 아래 신선한 사전 데워진 XF/FF 컬쳐 배지와 교환합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.
IPSC 식민지의 형성을 관찰할 때까지, 위상 대비 현미경으로 매일 세포 배양을 모니터링합니다. 이 프로토콜의 목적은 비 통합 리프로그래밍 방법을 사용하여 복부 피부에서 분리 된 진피 섬유 아세포를 다시 프로그래밍하는 것이었습니다. 인간의 섬유아세포는 배양 1주일 이내에 복부 피부 샘플에서 자라서 2주 이내에 85%의 합류에 도달했습니다.
세포는 플라스틱 배양 접시에 접착제 성장을 특징으로하고, 그들의 형태는 길쭉하고 스핀들 모양에서 평평하고 별 모양에 이르기까지 다양했다. 섬유아세포 형태와 배열 및 배양은 BMM에 시드후 극적으로 변경, 그들은 길쭉한 형태를 취득하고 얇은 분기 구조를 형성하도록 배열 할 때. 작은 식민지는 이미 첫 번째 트랜스펙트에서 첫날 에 문화에서 볼 수 있었고, 그 크기는 시간이 지남에 따라 점진적으로 증가, 그 수는 7 일까지 증가하고 다음 하루 사이에 안정적으로 유지 14, 아마 더 큰 식민지를 형성하기 위해 병합 작은 식민지의 결과로.
항생제 없는 매체를 사용하여 재프로그래밍 절차가 수행되었기 때문에 멸균 조건이 보장되지 않은 경우 미생물 오염이 주요 문제가 되었습니다. 증식율과 도금 밀도는 재프로그래밍 효율에 영향을 미치므로 세포 패시징을 계획하고 세포 증식율에 기초하여 도금 밀도를 정의하는 것이 중요합니다. 적절한 제노프리 시약을 위해 동물 유래 시약을 대체하는 이 프로토콜은 임상용이 아닌 완전한 제노없는 배양 환경에서 성인 인간 섬유아세포를 IPS 세포로 리프로그래밍할 수 있게 합니다.
인간 세포는 혈액 성 병원균감염의 잠재적 인 소스, 따라서, 개인 보호 장비는 절차를 통해 착용해야합니다.
