Aşağıdaki protokol, deri yumruk biyopsisinden izole edilen insan dermal fibroblastlarının hızlı ve verimli bir şekilde yeniden programlanması yoluyla otolog insan kaynaklı pluripotent kök hücreler üretmek için talimatlar sağlar. İşlemler, hücre yeniden programlamakonusunda çok az deneyimi olan veya hiç deneyimi olmayan araştırmacılar tarafından yapılabilir ve uygun ayarlama ile kseno-serbest indüklenen pluripotent kök hücrelerin inproduct sağlar. Otolog IPS hücreleri rejeneratif tıp uygulamaları ve genetik bozukluklar veya kanser gibi hastalıkların modelalınmasında altta yatan moleküler mekanizmaları araştırmak ve daha spesifik tedaviler geliştirmek için kullanılabilir.
İş yükü yüksek. Reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması gereken adımlar da dahil olmak üzere, deneyi dikkatlice planlamadan önce protokolü incelemek son derece yararlıdır. Prosedürün görsel gösterimi, çok az deneyimi olan veya hiç deneyimi olmayan araştırmaların hücre izolasyonunu ve yeniden programlamayı gerçekleştirmesine yardımcı olarak, olası mikrobiyal ve RNA kontaminasyonuyla ilgili yaygın hatalardan kaçınır.
Steril bir kaputun altında, karından elde edilen taze insan derisi örneğini HPSS solüsyonu ile 100 milimetrelik bir tabakta yıkayın. Ince çalgılar ve makas kullanarak saç ve yağ çıkarın ve bir milimetre tarafından iki milimetre büyüklüğünde parçaları elde etmek için bir neşter ile incelemek, izleri kaçınarak, doku kirli veya yanmış alanlarda. Her 35 milimetrelik tabağa dört küçük parça yerleştirin, steril bir kapak camı ile kaplayın ve 1,5 milimetre I-DMEM ekleyin.
Plakaları yaklaşık 15 gün boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle veya hücreler %85'e ulaşana kadar kuluçkaya yatırın. Her üç günde bir kültür ortamını değiştirin ve her gün ters faz kontrastmikroskobu kullanarak hücrelerin büyümesini kontrol edin. Şimdi, ince forseps ile kapak gözlük kaldırın, baş aşağı 100 milimetrelik çanak yerleştirin ve 1X steril PBS ile yıkayın.
Örneklerin parçalarını çıkarın ve atın. 1X steril PBS ile yıkama plakaları. 1X PBS'yi çıkarın ve 100 milimetrelik tabağa yerleştirilen kapak camlarına üç milimetre Tripsin-EDTA ekleyin ve 35 milimetrelik yemeklere bir milimetre Trypsin-EDTA ekleyin.
%5 karbondioksitle 37 derecede beş dakika kuluçkaya yat. Daha sonra, 100 milimetrelik tabağa beş milimetre TSS ve her 35 milimetrelik tabağa iki milimetre TSS ekleyerek tripsinizasyonu engelleyin. Süspansiyonu 15 milimetrelik steril tüplere, santrifüjü 400 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika toplayın.
Supernatant aspire ve I-DMEM 12 milimetre pelet resuspend. Hücre süspansiyonuna üç milimetrelik bir erte bölün ve her biri 60 milimetrelik bir plakaya aktarın. %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat.
Orta yı günlük olarak değiştirin. Hücreleri %75'lik bir kesişme olana kadar kültürde tutun, bundan sonra dört hücreyi elde etmek için tripsinizasyonu üç kez tekrarlayın. Daha sonra, I-DMEM'i S-DMEM ile değiştirerek hücreleri senkronize edin ve %5 karbondioksit le 37 derecede 48 saat kuluçkaya yatırın.
Hücre senkronizasyonu sırasında, fibroblast sızma programlama için fibroblast genişleme ortamı nı ve toplam modifiye edilmeyen RNA yeniden programlama kokteylini hazırlayın. Daha sonra 36 ayrılır modifiye olmayan RNA aliquots dokuz tüplerhazırlanmasını kolaylaştırmak için, biz başlık duvara bağlı bir düzeni takip etmek için kullanılır. Kat 24-iyi plaka bodrum membran matris 100 mikrolitre aktararak her kuyuda buz üzerinde çözülmüş alt kapsayacak şekilde çözülmüş.
Hücreleri tohumlamadan önce en az bir saat 37 santigrat derecede kuluçkaya yat. Kültür hücreleri ile plakalardan orta aspire ve hızlı bir şekilde 1X PBS içinde yıkayın. Beş geçişi hücreleri elde etmek için trypsinization tekrarlayın.
Supernatant aspire ve fibroblast genleşme orta uygun bir hacimde pelet resuspend. Hemositometreyi %70 alkolle hazırlayın ve temizleyin. Daha sonra, 10 mikrolitre trypan mavisini ve 10 mikrolitre hücre süspansiyonünü 1,5 mililitrelik bir tüpte hafifçe karıştırarak bir çözüm hazırlayın ve oda sıcaklığında bir ila iki dakika kuluçkaya yatırın.
Pipet 10 mikrolitre çözeltiyi hemositometreye yerleştirin ve saymak için ters faz kontrast mikroskobu sahnesine yerleştirin. Canlı olmayan hücreler mavi, canlı hücreler ise lekesizdir. Hücreleri hemositometre odasının en az iki karesinde sayın.
Fibroblast genleşme ortamının 500 mikrolitresi başına dördüncü hücrelere 2,5 kat 10 yoğunluk elde etmek ve hücre peletini yeniden askıya almak için seyreltme yapın. Pipet 24 kuyuplakaher kuyuiçine hücre süspansiyon 500 mikrolitre. Hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.
Sabahları, her kuyudan eski ortamı çıkarın ve 500 mikrolitre önceden silahsız xeno-free kültür ortamı ile değiştirin. En az altı saat boyunca %5 karbondioksit inkantigrat%37 santigrat derecede kuluçka. Oda sıcaklığında toplam nmRNA yeniden programlama kokteyl beş 15,4 mikrolitre aliquots çözülme sonra buz onları yerleştirin.
Her aliquot azaltılmış serum orta 234,6 mikrolitre ekleyin, hafifçe pipet üç ila beş kez ve tüp A.Label beş steril RNase-free 0.5 mililitre tüpler tüp B olarak etiket ve 244 mikrolitre azaltılmış serum orta sentetik küçük müdahale RNA transfeksiyon reaktif ivedi altı mikrolitre. Daha sonra, bir tüp A damla akıllıca her tüp B içeriğini eklemek için pipetler kullanın. Tüpün dibine dokunarak karıştırın.
15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Bundan sonra, her beş aliquots her beş aliquots nmRNA transfection karmaşık çözelti 125 mikrolitre eklemek için, plaka ve pipet orta akıllıca damla eğim. 20 kuyudaki içeriği hafifçe sallayarak karıştırın.
Geri kalan dört kuyuyu referans olarak kullanın. Plakayı 15 saat boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, orta aspire.
Steril kaputun altında, transfeksiyon işlemini tekrarlayın, ilk gün olduğu gibi, her gün üç gün daha. Beşinci gün, steril bir başlık altında taze, önceden ısıtılmış XF / FF Kültür Orta ile orta aspire ve değişim. Plakayı 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.
IPSC kolonilerinin oluşumunu gözlemleyene kadar hücre kültürünü her gün faz kontrastmikroskobuyla izleyin. Bu protokolün amacı, abdominal deriden izole edilen dermal fibroblastların entegre olmayan yeniden programlama yöntemi ile yeniden programlanmasıdır. İnsan fibroblastları, kültürden sonraki bir hafta içinde karın derisi örneklerinden artarak iki hafta içinde %85'e ulaştı.
Hücreler plastik kültür yemeklerinde yapışkan büyüme ile karakterize edildi ve morfolojileri uzamış ve iğ şeklindeki düzleştirilmiş ve yıldız şeklindeydi. Fibroblast morfolojisi ve düzenleme ve kültür, BMM'de tohumlamadan sonra, uzatılmış bir morfoloji edinip ince dallı yapılar oluşturacak şekilde düzenlenmiş olarak önemli ölçüde değişmiştir. Küçük koloniler ilk transfection'dan itibaren ilk gün kültürde zaten görülebiliyordu ve sayıları zamanla giderek arttı, yedinci güne kadar sayıları arttı ve daha sonra muhtemelen daha büyük koloniler oluşturmak için birleşen küçük kolonilerin bir sonucu olarak, yedinci gün ile 14.
Yeniden programlama işlemi antibiyotiksiz ortam kullanılarak yapıldığından, steril koşulların garanti altına alınmadığı durumlarda mikrobiyal kontaminasyon önemli bir sorun haline geldi. Proliferasyon hızı ve kaplama yoğunluğu yeniden programlama verimliliğini etkilediğinden, hücre geçişini planlamak ve hücre çoğalma hızı temelinde kaplama yoğunluğunu tanımlamak önemlidir. Uygun kseno-free reaktifler için hayvan türetilmiş reaktifler ikame, bu protokol onların klinik kullanımı değildi tam bir xeno-free kültür ortamında IPS hücrelerine yetişkin insan fibroblastların yeniden programlanması sağlar.
İnsan hücreleri kan yoluyla bulaşan patojenler ile enfeksiyon potansiyel bir kaynak, bu nedenle, kişisel koruyucu ekipman işlem boyunca giyilmelidir.
