Следующий протокол содержит инструкции по генерации аутологичной индуцированной человеком плюрипотентных стволовых клеток путем быстрого и эффективного перепрограммирования человеческих кожных фибробластов, изолированных от биопсии пунша кожи. Процедуры могут быть проведены исследователями с небольшим опытом или в отсутствие опыта в перепрограммировании клеток и при надлежащей корректировке, позволяет продукт ксено-свободных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Аутологичные IPS-клетки могут быть использованы для регенеративной медицины приложений и для моделирования заболеваний, таких как генетические расстройства или рак, чтобы исследовать основные молекулярные механизмы и разработать более конкретные методы лечения.
Нагрузка высока. Чрезвычайно полезно изучить протокол до тщательного планирования эксперимента, включая шаги, в ходе которых должны быть подготовлены реагенты и материалы. Визуальная демонстрация процедуры помогает исследованиям практически без опыта выполнять изоляцию клеток и перепрограммирование, избегая распространенных ошибок, связанных с возможным микробным и РНК-загрязнением.
Под стерильным капюшоном вымойте свежеприготовленный образец человеческой кожи из живота в 100-миллиметровую тарелку с раствором HPSS. Удалите волосы и жир с помощью тонких типсов и ножниц и вскрыть его скальпелем, чтобы получить фрагменты размером два миллиметра на один миллиметр, избегая шрамов, грязных или сожженных областей ткани. Поместите четыре небольших фрагмента в каждое 35-миллиметровое блюдо, накройте стерильным стеклом крышки и добавьте 1,5 миллиметра I-DMEM.
Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение примерно 15 дней или до тех пор, пока клетки достигают 85% слияния. Изменение среды культуры каждые три дня и проверить результат клеток с помощью перевернутой фазы контрастного микроскопа ежедневно. Теперь поднимите крышку стекла с тонкой типсы, поместите их вверх дном в 100-миллиметровое блюдо и мыть с 1X стерильных PBS.
Удалите фрагменты образцов и отбросьте их. Вымойте пластины с 1X стерильным PBS. Снимите 1X PBS и добавьте три миллиметра трипсина-ЭДТА в крышку стаканов, помещенных в 100-миллиметровую тарелку, и добавьте один миллиметр трипсина-ЭДТА к 35-миллиметровым блюдам.
Инкубировать в течение пяти минут при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. Затем заблокив трипсинизацию, добавив пять миллиметров TSS к 100-миллиметровой тарелке и два миллиметра TSS к каждому 35-миллиметровому блюду. Соберите подвеску в 15-миллиметровые стерильные трубки, центрифугу при 400 градусах G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.
Аспирировать супернатант и повторно изымать гранулы в 12 миллиметров I-DMEM. Разделите подвеску ячейки на три миллиметра aliquots и передать их каждый в 60 миллиметров пластины. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом.
Изменение среды ежедневно. Держите клетки в культуре, пока они не достигнут слияния 75%После этого, повторить трипсинизации три раза, чтобы получить клетки, которые проходят четыре. Затем синхронизировать клетки, заменив I-DMEM с S-DMEM и инкубировать в течение 48 часов при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислого газа.
Во время синхронизации клеток, подготовить фибробластового расширения среднего и общего неизмененого РНК перепрограммирования коктейль для фибробластов свободного программирования. Чтобы упростить подготовку девяти трубок неизмененых РНК-алицитов, которые затем делятся на 36, мы использовали для следовать схеме, которую мы прикрепили к стене капота. Пальто 24-хорошо пластины путем передачи 100 микролитров мембранной матрицы подвала размороженной на льду, чтобы каждый хорошо равномерно покрыть дно.
Инкубировать, по крайней мере один час при 37 градусов по Цельсию до посева клеток. Аспирировать среду из пластин с клетками в культуре и быстро мыть в 1X PBS. Повторите трипсинизацию, чтобы получить клетки, которые пролетят пять.
Аспиратировать супернатант и повторно помыть гранулы в соответствующем объеме фибробластовой среды расширения. Подготовка и очистка гемоцитометра с 70% алкоголя. Затем приготовьте раствор, аккуратно смешивая 10 микролитров трипан-голубого и 10 микролитров клеточной подвески в 1,5 миллилитровой трубке и инкубировать в течение одной-двух минут при комнатной температуре.
Пипетка 10 микролитров раствора в гемоцитометр и поместите его на стадии перевернутой фазы контрастного микроскопа для подсчета. Не жизнеспособные клетки синие, в то время как жизнеспособные клетки не окрашены. Подсчитайте клетки по крайней мере в двух квадратах гемоцитометра камеры.
Выполните разбавление, чтобы получить плотность в 2,5 раза от 10 до четвертых клеток на 500 микролитров фибробластовой среды расширения и повторно использовать клеточные гранулы. Pipette 500 микролитров клеточной подвески в каждом колодец из 24-хорошо пластины. Инкубационые клетки на ночь при 37 градусах цельсия и 5%углекислом газе.
Утром снимите старую среду с каждой колодец и замените ее 500 микролитров предварительно зазастерной ксено-свободной среды культуры без факторов. Инкубационный при 37%градусах по Цельсию под 5%углекислый газ, по крайней мере шесть часов. Оттепель пять 15,4 микролитер aliquots общего nmRNA перепрограммирования коктейль при комнатной температуре затем поместить их во льду.
Добавьте 234,6 микролитров уменьшенной среды сыворотки к каждой алиците, аккуратно пипетку три-пять раз и помечайте каждую из них как трубку A.Label пять стерильных RNase-бесплатных 0,5 миллилитров трубок в качестве трубки B и смешайте шесть микролитров синтетического малого интерфектного реагента РНК с 244 микролитровами среды сыворотки. Затем используйте пипетки, чтобы добавить содержимое каждой трубки B в трубку капли мудрым. Смешайте, нажав на дно трубки.
Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут. После этого, чтобы добавить 125 микролитров nmRNA трансфекции комплексного решения от каждого из пяти aliquots к каждой хорошо, наклон пластины и пипетки падение мудрым в среду. Смешайте содержимое в 20 скважинах, мягко качая.
Используйте оставшиеся четыре скважины в качестве эталона. Инкубировать пластину в течение 15 часов при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. На следующий день, аспирировать среды.
Под стерильным капотом повторите процедуру трансфекции, как в первый день, каждый день еще три дня. На пятый день, аспирировать среды и обмена со свежими, предварительно нагревается XF / FF культуры среднего под стерильным капюшоном. Инкубировать пластину при 37 градусах цельсия и 5%углекислом газе.
Мониторинг клеточной культуры ежедневно фазовым контрастным микроскопом, до наблюдения за образованием колоний IPSC. Целью этого протокола было перепрограммировать кожные фибробласты, изолированные от брюшной кожи с помощью неинтегрального метода перепрограммирования. Фибробласты человека переросли из образцов брюшной кожи в течение одной недели после культуры и достигли 85% слияния в течение двух недель.
Клетки характеризовались клеевым ростом на пластиковых блюдах культуры, и их морфология варьировалась от удлиненной и шпиндельной формы до сплющенной и звездообразной. Фибробластовая морфология, расположение и культура резко изменились после посева на БММ, когда они приобрели удлиненную морфологию и организовали формирование тонких разветвленных структур. Небольшие колонии уже были видны в культуре в первый день с первого трансфекции и их размер постепенно рос с течением времени, в то время как их число увеличилось до седьмого дня, а затем оставался стабильным между днем семь и день 14, вероятно, в результате небольших колоний слияния в форме больших колоний.
Поскольку процедура перепрограммирования проводилась с использованием средств массовой информации, свободных от антибиотиков, в случае, если стерильные условия не были гарантированы, микробное загрязнение стало серьезной проблемой. Скорость пролиферации и плотность покрытия влияют на эффективность перепрограммирования, поэтому важно планировать проемы клеток и определять плотность покрытия на основе скорости пролиферации клеток. Замена реагентов животного происхождения на соответствующие реагенты, свободные от ксено, этот протокол позволяет перепрограммировать фибробласты взрослого человека в IPS-клетки в полной среде культуры, свободной от ксено, которая не была их клиническим использованием.
Клетки человека являются потенциальным источником инфекции с патогенными микроорганизмами, передающихся через кровь, следовательно, средства индивидуальной защиты следует носить на протяжении всей процедуры.
