نظام ثقافتنا يلتقط اللدونة الظاهرية من خلايا سرطان الخلايا الحرشفية الرئة استجابة لتفاعلات الورم stroma وكيف تنظم هذه التفاعلات مورفولوجيا الورم خلال تطور سرطان الخلايا الحرشفية في الرئة. الميزة الرئيسية لنظامنا هو قدرته على نموذج بيولوجيا الخلايا الحرشفية الرئة في سياق 3D مع الحفاظ على اللدونة من الخلايا الخبيثة. توفر هذه الثقافة المشتركة ثلاثية الأبعاد نظامًا فريدًا للتحقيق في تفاعلات الخلايا الورمية القوية ويمكن تكييفها لمراقبة استجابات خلايا سرطان الخلايا الحرشفية في الرئة والأورام الليفية المرتبطة بالسرطان لعلاج الدواء.
للبدء، ذوبان قنينات مصفوفة غشاء الطابق السفلي في ثلاجة أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. تهدئة الماصات البلاستيكية ملليلتر ونصائح في ناقص 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، تدفئة الكواشف المستخدمة لتفكك الخلايا TUM622 ، العازلة HEPES ، التربسين / EDTA ، و عازلة تحييد التربسين في حمام مائي 37 درجة مئوية.
خذ مصفوفة غشاء الطابق السفلي المذابة من الثلاجة ووضع القارورة على الجليد. يبرد لوحات ثقافة الأنسجة على برودة منصة معدنية وضعت على الجليد. ضع أنابيب الطرد المركزي على رف تبريد معدني على الجليد.
حساب كمية الخلايا اللازمة على أساس عدد الآبار وتركيز الخلايا في كل بئر لتكون مستعدة. نقل TUM622 تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي المبرد وتدور في 300 مرة ز في جهاز طرد مركزي دلو معلقة في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. مع ماصة التعرق تعلق على طرف غير المصفاة، pirate عظمى بعناية، وترك ما يقرب من 200 ميكرولترات من المتوسطة في الأنبوب.
اضغط بلطف على جانب الأنبوب لإزاحة البيليه وفكها ثم إعادتها إلى رف التبريد. باستخدام ماصات مُبَرَّكة من مليلترتين، اخلط بلطف المصفوفة على الجليد عن طريق الأنابيب صعوداً وهبوطاً عدة مرات. الماصات في سرعة حتى ومعتدل بحيث يتم إدخال أي فقاعات في المصفوفة أثناء هذا الإجراء.
نقل 1.1 ملليلتر من المصفوفة إلى كل أنبوب طرد مركزي. باستخدام النصائح precooled، ماصة المصفوفة في كل أنبوب صعودا وهبوطا حوالي 10 مرات لجعل تعليق خلية موحدة. نقل 310 ميكرولترات من تعليق مصفوفة الخلية في كل بئر من لوحة 24-جيدا.
ضع الماصات بزاوية 90 درجة على سطح اللوحة وأضف التعليق إلى مركز البئر. التعليق ينتشر ويغطي البئر بأكمله. لتسهيل تحليل الفلورة المناعية المصب، نقل 60 ميكرولترات من تعليق مصفوفة الخلية إلى مركز البئر من شريحة غرفة بئرين.
وهذا يسمح للمصفوفة لتشكيل هيكل يشبه القبة مع حجم أصغر بكثير. العودة لوحة وغرفة الشريحة مرة أخرى إلى حاضنة ثقافة الأنسجة واحتضان لمدة 30 دقيقة للسماح للمصفوفة لترسيخ. بعد ذلك، فحص لوحة والانزلاق تحت مجهر الضوء لضمان أن يتم توزيع الخلايا الفردية بالتساوي داخل المصفوفة.
أضف ملليلتر واحد من ثقافة ثلاثية الأبعاد ساخنة مسبقًا بشكل كامل في كل بئر من الآبار و1.5 ملليلتر من 3D ثقافة متوسطة في كل بئر من شريحة الغرفة ، ثم إعادتها إلى الحاضنة. بعد إعداد تعليق الخلية من TUM622 وCAFs كما هو موضح سابقا، عد كثافة الخلية CAF عن طريق خلط 10 ميكرولترات من تعليق الخلية مع 10 ميكرولترات من الأزرق trypan. إضافة 10 ميكرولترات من الخليط إلى كل من الغرفتين على قياس الهيموزيت لحساب وحساب كثافة الخلية.
لتضمين الخلايا TUM622 و CAFs في مصفوفة غشاء الطابق السفلي، أولاً حساب العدد المطلوب من الخلايا المستخدمة في الطلاء استناداً إلى معلومات كثافة الخلايا. يتم تصنيف CAFs بنسبة 2:1 من خلايا TUM622. نقل حجم محسوبة من TUM622s وكذلك تعليق الخلية CAF في نفس أنبوب الطرد المركزي.
تدور أسفل وpirate كل المتوسطة. Resuspend في مصفوفة غشاء الطابق السفلي ولوحة 310 ميكرولترات من الخليط في كل بئر من لوحة 24-جيدا. بالنسبة للفلوروس المناعي، نقل 60 ميكرولترات من خليط TUM622 و CAF إلى شرائح الغرفة كما هو موضح سابقا.
لزراعة االتكتميم TUM622 مع CAFs مضاف في مصفوفة غشاء الطابق السفلي، أول إعداد TUM622 أحادية الثقافة كما هو موضح سابقا، ونقل ضعف عدد تعليق CAF في أنبوب الطرد المركزي، وتدور في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استلهمت من فوق و resuspend CAFs في الوسط الثقافة، نقل ضعف عدد الخلايا CAF التي تم إعادة تعليقها في وسط الثقافة في كل من الآبار التي تحتوي على الخلايا TUM622 جزءا لا يتجزأ. يتم تقريب خلايا TUM622 النموذجية في الثقافة 2D مع نواة كبيرة في حين أن CAFs مسطحة وممدود.
بذر في ثقافة 3D، كانت خلايا TUM622 واحدة قادرة على تشكيل organoids مع المورفولوجيا acinarlike عندما جزءا لا يتجزأ. بين الأيام الخامسة والسابعة، أصبح التجويف واضحاً في الهياكل الشبيهة بالتجويف وظلت جوفاء بعد ذلك. كل acinus، تتألف من أحادية من الخلايا المحيطة تجويف تجويف، وعرض القطب الأساسي apical المناسبة مماثلة لتلك التي من ظهارة الرئة في الجسم الحي.
وكانت هذه الهياكل acinarlike hyperplastic واستمر في النمو حتى 24 يوما قبل مصفوفة خارج الخلية تفككت تماما. في الثقافات المشتركة TUM622-CAF، إما تراكب أو شارك في تضمين، وجود CAFs عزز إلى حد كبير عدد وحجم الزفير التي تشكلت. ومن المثير للاهتمام, عندما جاء TUM622 acini إلى قرب وثيق مع CAFs, أنها تسببت acini لتصبح الغازية والهجرة نحو CAFs, تشكيل الهياكل المسيل للدموع مثل.
لضمان تشكيل قوي من هياكل acinarlike، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على مصفوفة غشاء الطابق السفلي في شكله السائل خلال عملية كاملة من تضمين الخلايا. يمكن استخدام العضيات TUM622 لمجموعة متنوعة من التحليلات المصب، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، المناعة، والكيمياء المناعية، وقياس التدفق، والRNA واستخراج البروتين، ويمكن أيضا أن تعدل لفحص المخدرات. باستخدام هذا النظام كمنصة، يمكن للمرء أن التحقيق في كيفية الخلايا الورم الجوهرية وكذلك التغيرات الخارجية الخلية في البيئة الدقيقة الورم يمكن أن تؤثر على بنية الورم الظهارية وتشكيل سرطان.
