Nosso sistema de cultura captura a plasticidade fenotípica das células carcinoma escamosas do pulmão em resposta às interações tumorais-estroma e como essas interações regulam a morfologia tumoral durante a progressão do carcinoma de células escamosas pulmonares. A principal vantagem do nosso sistema é sua capacidade de modelar a biologia celular escímnea pulmonar em um contexto 3D, preservando a plasticidade das células malignas. Esta cocultura 3D fornece um sistema único para investigar interações células tumorais-estromoma e poderia ser adaptada para monitorar respostas de células escamosas células pulmonares células cancerígenas e fibroblastos associados ao câncer para o tratamento medicamentoso.
Para começar, descongele frascos de matriz de membrana de porão em uma geladeira de quatro graus Celsius durante a noite. Esfrie as pipetas plásticas de dois mililitros e as pontas a menos 20 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, aqueça os reagentes usados para dissociar células TUM622, tampão HEPES, trippsina/EDTA e tampão de neutralização de trippsina em um banho de água de 37 graus Celsius.
Tire a matriz de membrana do porão descongelada da geladeira e coloque o frasco no gelo. Esfrie as placas de cultura tecidual em um refrigerador de plataforma metálica colocado no gelo. Coloque tubos de centrífugas em um rack de resfriamento de metal no gelo.
Calcule a quantidade de células necessárias com base no número de poços e na concentração de células em cada poço a ser preparado. Transfira a suspensão celular TUM622 em um tubo de centrífuga resfriado e gire a 300 vezes g em uma centrífuga de balde pendurado a quatro graus Celsius por cinco minutos. Com uma pipeta aspirada presa a uma ponta não filtrada, aspire o supernatante cuidadosamente, deixando aproximadamente 200 microliters do meio no tubo.
Toque suavemente na lateral do tubo para desalojar e dissociar a pelota e, em seguida, devolvê-la ao rack de resfriamento. Usando as pipetas pré-coloniais de dois mililitros, misture suavemente a matriz no gelo, pipetando para cima e para baixo algumas vezes. Pipeta a uma velocidade uniforme e moderada para que nenhuma bolha seja introduzida na matriz durante este procedimento.
Transfira 1,1 mililitros da matriz para cada tubo de centrífuga. Usando pontas pré-torneadas, pipete a matriz em cada tubo para cima e para baixo cerca de 10 vezes para fazer uma suspensão de célula uniforme. Transfira 310 microliters da suspensão da matriz celular para cada poço de uma placa pré-transformada de 24 poços.
Coloque a pipeta em um ângulo de 90 graus à superfície da placa e adicione a suspensão ao centro do poço. A suspensão se espalha e cobre todo o poço. Para facilitar a análise da imunofluorescência a jusante, transfira 60 microlitadores de suspensão da matriz celular para o centro do poço de um escorregador de câmara de dois poços.
Isso permite que a matriz forme uma estrutura semelhante a uma cúpula com volume muito menor. Devolva a placa e a câmara deslize de volta para a incubadora de cultura tecidual e incubar por 30 minutos para permitir que a matriz se solidifique. Depois disso, examine a placa e deslize sob um microscópio de luz para garantir que as células únicas sejam distribuídas uniformemente dentro da matriz.
Adicione um mililitro de cultura 3D pré-aquecida em cada poço da placa e 1,5 mililitros de cultura 3D em cada poço do escorregador da câmara, em seguida, devolva-os à incubadora. Após a preparação de suspensões celulares de TUM622 e CAFs como descrito anteriormente, conte a densidade celular CAF misturando 10 microlitadores de suspensão celular com 10 microliters de azul tripano. Adicione 10 microliters da mistura a cada uma das duas câmaras no hemótmetro para contar e calcular a densidade celular.
Para co-incorporar células TUM622 e CAFs na matriz de membrana do porão, primeiro calcule o número desejado de células usadas para chapeamento com base nas informações de densidade celular. Os CAFs são semeados a uma proporção de 2:1 de células TUM622. Transfira o volume calculado de TUM622s, bem como a suspensão celular CAF para o mesmo tubo de centrífuga.
Gire para baixo e aspire todos os meios. Resuspend na matriz de membrana do porão e placa 310 microliters da mistura em cada poço de uma placa de 24 poços. Para imunofluorescência, transfira 60 microlitres de misturas TUM622 e CAF para lâminas de câmara, conforme descrito anteriormente.
Para a cocultura TUM622 com CAFs sobrepostos na matriz de membrana do porão, primeiro configure monocultura TUM622 como descrito anteriormente, transfira o dobro do número de suspensão de CAF para um tubo de centrífuga e gire a 300 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente. Aspirar o supernasce e resuspensar os CAFs em meio de cultura, transferir o dobro do número de células CAF que foram resuspengidas em meio de cultura em cada um dos poços contendo as células TUM622 incorporadas. As células TUM622 típicas na cultura 2D são arredondadas com grandes núcleos, enquanto os CAFs são planos e alongados.
Semeadas na cultura 3D, as células tum622 individuais eram capazes de formar organoides com morfologias acinarlike quando incorporadas. Entre os dias cinco e sete, um lúmen tornou-se aparente nas estruturas acinarlike e permaneceu oco depois disso. Cada acinus, composto por uma monocamada de células ao redor do lúmen oco, exibia a polaridade basal apical adequada semelhante à do epitélio pulmonar in vivo.
Essas estruturas acinarlike eram hiperplásticas e continuaram a crescer até 24 dias antes da matriz extracelular se desintegrar completamente. Nas coculturas TUM622-CAF, seja sobreposta ou co-incorporação, a presença de CAFs aumentou consideravelmente o número e o tamanho dos esferoides formados. Curiosamente, quando tum622 acini entrou em proximidade com cafs, eles induziram o acini a se tornar invasivo e migrar em direção aos CAFs, formando estruturas semelhantes a lágrimas.
Para garantir uma formação robusta de estruturas acinarlike, é fundamental manter a matriz de membrana do porão em sua forma líquida durante todo o processo de incorporação das células. Os organoides TUM622 podem ser usados para uma variedade de análises a jusante, incluindo, mas não se limitando a imunofluorescentes, imunohistoquímica, citometria de fluxo, RNA e extração de proteínas, e também podem ser modificados para triagem de medicamentos. Usando esse sistema como plataforma, pode-se investigar como as alterações intrínsecas das células tumorais, bem como as alterações extrínsecas celulares no microambiente tumoral podem influenciar a arquitetura epitelial do tumor e a formação de carcinoma.
