Notre système de culture capture la plasticité phénotypique des cellules squameuses de carcinome de poumon en réponse aux interactions tumeur-stroma et comment ces interactions régulent la morphologie de tumeur pendant la progression squamous de carcinome de cellules de poumon. Le principal avantage de notre système est sa capacité à modéliser la biologie cellulaire squameux pulmonaire dans un contexte 3D tout en préservant la plasticité des cellules malignes. Cette coculture 3D fournit un système unique pour étudier les interactions tumeur-stroma cellulaire et pourrait être adaptée pour surveiller les réponses des cellules du carcinome épithème pulmonaire et des fibroblastes associés au cancer au traitement médicamenteux.
Pour commencer, décongeler les flacons de la matrice membranaire du sous-sol dans un réfrigérateur de quatre degrés Celsius pendant la nuit. Refroidissez les pipettes en plastique de deux millilitres et les pointes à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, réchauffez les reagents utilisés pour dissocier les cellules TUM622, le tampon HEPES, la trypsine/EDTA et le tampon de neutralisation de la trypsine dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius.
Sortez la matrice de membrane du sous-sol décongelée du réfrigérateur et mettez le flacon sur la glace. Refroidir les plaques de culture tissulaire sur un refroidisseur de plate-forme métallique placé sur la glace. Déposer les tubes de centrifugeuse sur une grille de refroidissement métallique sur la glace.
Calculer la quantité de cellules nécessaires en fonction du nombre de puits et de la concentration de cellules dans chaque puits à préparer. Transférer la suspension cellulaire TUM622 dans un tube de centrifugeuse refroidi et faire tourner à 300 fois g dans une centrifugeuse suspendue à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. À l’aide d’une pipette aspirante fixée à une pointe non filtrée, aspirer soigneusement le surnatant, en laissant environ 200 microlitres du milieu dans le tube.
Tapez doucement sur le côté du tube pour déloger et dissocier la pastille, puis retournez-la à la grille de refroidissement. À l’aide des pipettes précoolées de deux millilitres, mélanger délicatement la matrice sur la glace en retentit de haut en bas à quelques reprises. Pipette à une vitesse constante et modérée de sorte qu’aucune bulle n’est introduite dans la matrice au cours de cette procédure.
Transférer 1,1 millilitres de la matrice dans chaque tube de centrifugeuse. À l’aide de pointes précoolées, pipette la matrice dans chaque tube de haut en bas environ 10 fois pour faire une suspension cellulaire uniforme. Transférer 310 microlitres de la suspension de la matrice cellulaire dans chaque puits d’une plaque précoolée de 24 puits.
Placez la pipette à un angle de 90 degrés à la surface de la plaque et ajoutez la suspension au centre du puits. La suspension s’étend et couvre l’ensemble du puits. Pour faciliter l’analyse de l’immunofluorescence en aval, transférez 60 microlitres de suspension matricielle cellulaire au centre du puits d’une glissière de chambre à deux puits.
Cela permet à la matrice de former une structure en forme de dôme avec un volume beaucoup plus faible. Retournez la plaque et la chambre glissez de nouveau dans l’incubateur de culture tissulaire et incubez pendant 30 minutes pour permettre à la matrice de se solidifier. Après cela, examiner la plaque et glisser sous un microscope léger pour s’assurer que les cellules simples sont réparties uniformément dans la matrice.
Ajoutez un millilitre de culture 3D préchauffée dans chaque puits de la plaque et 1,5 millilitres de milieu de culture 3D dans chaque puits de la diapositive de chambre, puis retournez-les à l’incubateur. Après avoir préparé des suspensions cellulaires de TUM622 et de CAF comme décrit précédemment, comptez la densité cellulaire caf en mélangeant 10 microlitres de suspension cellulaire avec 10 microlitres de bleu trypan. Ajouter 10 microlitres du mélange à chacune des deux chambres de l’hémocytomètre pour compter et calculer la densité cellulaire.
Pour co-intégrer les cellules TUM622 et les CAF dans la matrice membranaire du sous-sol, calculez d’abord le nombre désiré de cellules utilisées pour le placage en fonction de l’information sur la densité cellulaire. Les CEA sont ensemencés à un rapport de 2:1 des cellules TUM622. Transférez le volume calculé des TUM622 ainsi que la suspension des cellules CAF dans le même tube de centrifugeuse.
Tournez vers le bas et aspirez tous les moyens. Resuspendez dans la matrice membranaire du sous-sol et plaquez 310 microlitres du mélange dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Pour l’immunofluorescence, transférez 60 microlitres des mélanges TUM622 et CAF aux diapositives de chambre décrites précédemment.
Pour coculturer TUM622 avec des CAF superposés dans la matrice membranaire du sous-sol, installez d’abord la monoculture TUM622 comme décrit précédemment, transférez deux fois le nombre de suspensions CAF dans un tube de centrifugeuse, et faites tourner vers le bas à 300 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirer le surnatant et résusquer les CAF dans le milieu de la culture, transférer deux fois le nombre de cellules CAF qui ont été résuspendus dans le milieu de la culture dans chacun des puits contenant les cellules TUM622 incorporées. Les cellules typiques de TUM622 dans la culture 2D sont arrondies avec de grands noyaux tandis que les CAF sont plats et allongés.
Ensemencées en culture 3D, les cellules TUM622 simples étaient capables de former des organoïdes avec des morphologies acinarlike lorsqu’elles étaient incorporées. Entre les cinq et sept jours, un lumen est devenu apparent dans les structures acinarlike et est resté creux par la suite. Chaque acinus, composé d’un monocouche de cellules entourant le lumen creux, a montré la polarité basale apical appropriée semblable à celle de l’épithélium de poumon in vivo.
Ces structures acinarlike étaient hyperplastic et ont continué à se développer jusqu’à 24 jours avant que la matrice extracellulaire complètement désintégrée. Dans les cocultures TUM622-CAF, qu’il s’agit de superposition ou de co-intégration, la présence de CAF a considérablement augmenté le nombre et la taille des sphéroïdes formés. Fait intéressant, lorsque tum622 acini est venu à proximité avec les CAFs, ils ont incité les acini à devenir envahissants et à migrer vers les CAF, formant des structures en forme de larme.
Pour assurer la formation robuste de structures acinarlike, il est essentiel de maintenir la matrice membranaire du sous-sol sous sa forme liquide pendant tout le processus d’intégration des cellules. Les organoïdes TUM622 peuvent être utilisés pour une variété d’analyses en aval, y compris, sans s’y limiter, l’immunofluorescence, l’immunohistochimie, la cytométrie du débit, l’ARN et l’extraction des protéines, et peuvent également être modifiés pour le dépistage des médicaments. En utilisant ce système comme plate-forme, on peut étudier comment les changements intrinsèques de cellules de tumeur aussi bien que les changements extrinsèques de cellules dans le microenvironnement de tumeur peuvent influencer l’architecture épithéliale de tumeur et la formation de carcinome.
