Nuestro sistema de cultivo captura la plasticidad fenotípica de las células del carcinoma de células escamosas pulmonares en respuesta a las interacciones tumoral-estroma y cómo estas interacciones regulan la morfología tumoral durante la progresión del carcinoma de células escamosas pulmonares. La principal ventaja de nuestro sistema es su capacidad para modelar la biología celular escamosa pulmonar en un contexto 3D preservando la plasticidad de las células malignas. Esta cocultura 3D proporciona un sistema único para investigar las interacciones de las células tumoral-estroma y podría adaptarse para monitorear las respuestas de las células del carcinoma de células escamosas pulmonares y los fibroblastos asociados al cáncer al tratamiento farmacológico.
Para empezar, descongele los viales de la matriz de membrana del sótano en un refrigerador Celsius de cuatro grados durante la noche. Enfríe las pipetas y puntas de plástico de dos mililitros a menos 20 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, calienta los reactivos utilizados para disociar las células TUM622, el tampón HEPES, la trippsina/EDTA y el búfer de neutralización de la tripina en un baño de agua de 37 grados Centígrados.
Saque la matriz de membrana del sótano descongelada del refrigerador y coloque el vial sobre hielo. Enfríe las placas de cultivo de tejido en un enfriador de plataforma metálica colocado sobre hielo. Coloque los tubos centrífugos en un estante de refrigeración de metal sobre hielo.
Calcular la cantidad de células necesarias en función del número de pozos y la concentración de células en cada pozo a preparar. Transfiera la suspensión de la célula TUM622 a un tubo centrífugo refrigerado y gire hacia abajo a 300 g en una centrífuga de cucharón colgante a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Con una pipeta de aspiración unida a una punta sin filtrar, aspirar el sobrenadante cuidadosamente, dejando aproximadamente 200 microlitros del medio en el tubo.
Toque suavemente en el lado del tubo para desalojar y disociar el pellet y luego devolverlo al estante de enfriamiento. Usando las pipetas preenfriadas de dos mililitros, mezcle suavemente la matriz sobre hielo en pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces. Pipetear a una velocidad uniforme y moderada para que no se introduzcan burbujas en la matriz durante este procedimiento.
Transfiera 1,1 mililitros de la matriz a cada tubo centrífugo. Usando puntas preenfriadas, pipetee la matriz en cada tubo hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces para hacer una suspensión celular uniforme. Transfiera 310 microlitros de la suspensión de la matriz celular a cada pozo de una placa preenfriada de 24 pozos.
Coloque la pipeta en un ángulo de 90 grados con respecto a la superficie de la placa y añada la suspensión al centro del pozo. La suspensión se extiende y cubre todo el pozo. Para facilitar el análisis de inmunofluorescencia aguas abajo, transfiera 60 microlitros de suspensión de matriz celular al centro del pozo de un portaobjetos de dos pozos.
Esto permite que la matriz forme una estructura similar a una cúpula con un volumen mucho más pequeño. Vuelva a colocar la placa y la cámara en la incubadora de cultivo de tejido e incubar durante 30 minutos para permitir que la matriz se solidifique. Después de eso, examine la placa y deslice bajo un microscopio de luz para asegurarse de que las células individuales se distribuyen uniformemente dentro de la matriz.
Agregue un mililitro de 3D precalentó el medio completo en cada pozo de la placa y 1,5 mililitros de medio de cultivo 3D en cada pozo del portaobjetos de la cámara, luego vuelva a la incubadora. Después de preparar las suspensiones celulares de TUM622 y CAFs como se describió anteriormente, cuente la densidad de células CAF mezclando 10 microlitros de suspensión celular con 10 microlitros de azul tripano. Agregue 10 microlitros de la mezcla a cada una de las dos cámaras del hemocitoómetro para contar y calcular la densidad celular.
Para co-incrustar células TUM622 y CAF en la matriz de membrana del sótano, primero calcule el número deseado de células utilizadas para el chapado basado en la información de densidad celular. Los CAF se siembran en una proporción de 2:1 de las células TUM622. Transfiera el volumen calculado de TUM622s, así como la suspensión de células CAF al mismo tubo centrífugo.
Gira hacia abajo y aspira todo lo medio. Resuspender en la matriz de membrana del sótano y placa 310 microlitros de la mezcla en cada pozo de una placa de 24 pozos. Para la inmunofluorescencia, transfiera 60 microlitros de mezclas TUM622 y CAF a los portaobjetos de cámara como se describió anteriormente.
Para cocultivo TUM622 con CAF superpuestos en matriz de membrana de sótano, primero configure el monocultivo TUM622 como se describió anteriormente, transfiera el doble del número de suspensión CAF en un tubo centrífugo, y gire hacia abajo a 300 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspend los CAF en el medio de cultivo, transferir el doble del número de células CAF que fueron resuspendidas en medio de cultivo en cada uno de los pozos que contienen las células TUM622 incrustadas. Las células TUM622 típicas en cultivo 2D se redondean con núcleos grandes, mientras que los CAF son planos y alargados.
Semillas en cultivo 3D, células TUM622 individuales eran capaces de formar organoides con morfologías similares a las acinares cuando estaban incrustadas. Entre los días cinco y siete, un lumen se hizo evidente en las estructuras acinar y permaneció hueco a partir de entonces. Cada acinus, compuesto por una monocapa de células que rodeaban el lumen hueco, mostraba una polaridad basal apical adecuada similar a la del epitelio pulmonar in vivo.
Estas estructuras acinares eran hiperplásticas y continuaron creciendo hasta 24 días antes de que la matriz extracelular se desintegró por completo. En las coculturas TUM622-CAF, ya sea superpuestas o co-embedding, la presencia de CAF mejoró en gran medida el número y el tamaño de los esferoides formados. Curiosamente, cuando TUM622 acini llegó a la proximidad de los CAF, indujeron al acini a ser invasivo y migrar hacia los CAF, formando estructuras similares a lágrimas.
Para asegurar una formación robusta de estructuras similares a acinar, es fundamental mantener la matriz de membrana del sótano en su forma líquida durante todo el proceso de incrustación de las células. Los organoides TUM622 se pueden utilizar para una variedad de análisis posteriores, incluyendo pero no limitado a inmunofluorescente, inmunohistoquímica, citometría de flujo, ARN y extracción de proteínas, y también se pueden modificar para la detección de fármacos. Usando este sistema como plataforma, se puede investigar cómo las células tumorales intrínsecas, así como los cambios extrínsecos de células en el microambiente tumoral pueden influir en la arquitectura epitelial tumoral y la formación del carcinoma.
