Kültür sistemimiz, tümör-stroma etkileşimlerine yanıt olarak akciğer skuamöz hücreli karsinom hücrelerinin fenotipik plastisitesini ve bu etkileşimlerin akciğer skuamöz hücreli karsinom ilerlemesi sırasında tümör morfolojisini nasıl düzenlediğini yakalar. Sistemimizin en büyük avantajı, malign hücrelerin plastisitesini korurken akciğer skuamöz hücreli biyolojiyi 3Boyutlu bir bağlamda modelleme yeteneğidir. Bu 3D coculture tümör-stroma hücre etkileşimlerini araştırmak için benzersiz bir sistem sağlar ve ilaç tedavisi için akciğer skuamöz hücreli karsinom hücreleri ve kanser ilişkili fibroblastların yanıtlarını izlemek için adapte edilebilir.
Başlangıç olarak, bir gecede dört derecelik santigrat buzdolabında bodrum membran matris şişeleri çözültün. Bir gecede eksi 20 santigrat derecede iki mililitrelik plastik pipetleri ve uçları soğutun. Ertesi gün, TUM622 hücrelerini, HEPES tamponunu, trypsin/EDTA'yı ve 37 derecelik santigrat su banyosunda tripsin nötralizasyon tamponunu ayırmak için kullanılan reaktifleri ısıtın.
Çözülmüş bodrum membran matrisini buzdolabından çıkar ve şişeyi buza koy. Buz üzerine yerleştirilen metal bir platform soğutucu üzerinde doku kültür plakaları soğutun. Santrifüj tüpleri metal bir soğutma rafına buz üzerine yerleştirin.
Kuyu ların sayısına ve hazırlanacak her kuyudaki hücrelerin konsantrasyonuna göre gerekli olan hücre miktarını hesaplayın. TUM622 hücre süspansiyonu soğutulmuş bir santrifüj tüpüne aktarın ve dört derece santigrat derecede 300 kez aşağı doğru beş dakika boyunca aşağı doğru döndürün. Filtresiz bir uca bağlı bir boru ile, supernatant dikkatle aspire, tüp içinde orta yaklaşık 200 mikrolitre bırakarak.
Yavaşça çıkarmak ve pelet çıkarmak ve daha sonra soğutma rafına geri dönmek için tüpün yan dokunun. İki mililitrelik önceden soğutulmuş pipetleri kullanarak, matrisi birkaç kez yukarı ve aşağı borulandırarak buz üzerinde hafifçe karıştırın. Bu işlem sırasında matrisiçine kabarcıklar girilmesin diye düzgün ve orta hızda pipet.
Matrisin 1,1 mililitresini her santrifüj tüpüne aktarın. Önceden soğutulmuş ipuçları kullanarak, pipet tek tip bir hücre süspansiyon yapmak için her tüp yukarı ve aşağı yaklaşık 10 kez matris. Önceden soğutulmuş 24 kuyulu bir plakanın her kuyuya hücre matris süspansiyonunun 310 mikrolitresini aktarın.
Pipeti plaka yüzeyine 90 derecelik bir açıyla yerleştirin ve süspansiyonu kuyunun ortasına ekleyin. Süspansiyon yayılır ve tüm kuyukapsar. Downstream immünororesans analizini kolaylaştırmak için, 60 mikrolitre hücre matris süspansiyonu iki kuyulu bir hazne slaytın kuyu merkezine aktarın.
Bu matris çok daha küçük hacimli bir kubbe gibi bir yapı oluşturmak için izin verir. Plakayı ve hazneyi doku kültürü kuluçka makinesine geri döndürün ve matrisin katılaşabilmesi için 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, tek hücrelerin matris içinde eşit olarak dağıtıldığından emin olmak için plakayı ve kaydırağı ışık mikroskobu altında inceleyin.
Önceden ısıtılmış 3D kültür tam orta plaka her kuyu içine ve oda slayt her kuyu içine 3D kültür orta 1,5 mililitre ekleyin, sonra kuvöz onları geri dönün. TUM622 ve CAF'lerin hücre süspansiyonlarını daha önce açıklandığı gibi hazırladıktan sonra, 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ile 10 mikrolitre trypan mavisini karıştırarak CAF hücre yoğunluğunu sayın. Hücre yoğunluğunu saymak ve hesaplamak için hemositometredeki iki odanın her birine karışımın 10 mikrolitresini ekleyin.
TUM622 hücrelerini ve CAF'lerini temel membran matrisine birlikte yerleştirmek için, öncelikle hücre yoğunluğu bilgilerine dayanarak kaplama için kullanılan istenilen hücre sayısını hesaplayın. CAF'ler TUM622 hücrelerinin 2:1 oranında tohumlanır. Hesaplanan TUM622s hacmini ve CAF hücre süspansiyonunun aynı santrifüj tüpüne aktarılması.
Aşağı spin ve tüm orta aspire. 24 kuyulu bir plakanın her kuyusuna karışımın 310 mikrolitre taban zarı matrisi ve plakasında resuspend. İmmünofloresans için, 60 mikrolitre TUM622 ve CAF karışımlarını daha önce açıklandığı gibi oda slaytlarına aktarın.
Tum622'yi bodrum membran matrisinde üst üste bindirilmiş KAF'lerle bir arada teşekkreetmek için, ilk olarak tum622 monokültürünü daha önce açıklandığı gibi kurun, CAF süspansiyonunun iki katını santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez g'de aşağı doğru döndürün. Supernatant aspirate ve kültür orta CAFs resuspend, gömülü TUM622 hücreleri içeren kuyuların her içine kültür ortamda resuspended edildi CAF hücrelerinin iki katı sayıda aktarın. 2B kültürdeki tipik TUM622 hücreleri büyük çekirdeklerle yuvarlanırken, CAF'ler düz ve uzatılmış.
3D kültürde tohumlanmış tek TUM622 hücreleri gömülü olduğunda asinarbenzeri morfolojileri olan organoidler oluşturabiliyordu. Beş ve yedi gün arasında, bir lümen acinarlike yapılarda belirgin oldu ve bundan sonra içi boş kaldı. Her acinus, içi boş lümen çevreleyen hücrelerin bir monolayer oluşan, vivo akciğer epitel benzer uygun apikal bazal polarite gösterdi.
Bu asinarlike yapılar hiperplastikti ve hücre dışı matriks tamamen parçalanmadan 24 gün öncesine kadar büyümeye devam etti. TUM622-CAF kokültürlerinde, örtünme veya birlikte gömme, CAF'lerin varlığı oluşan küresellerin sayısını ve boyutunu büyük ölçüde artırmıştır. İlginçtir ki, TUM622 acini CAF'lere yakınlaştıklarında, acini'yi invaziv hale getirerek KAF'lere doğru göç etmeye ikna ettiler ve gözyaşı benzeri yapılar oluşturdular.
Acinarlike yapıların sağlam oluşumunu sağlamak için, hücreleri gömme tüm süreç boyunca sıvı formda bodrum membran matris korumak için önemlidir. TUM622 organoidleri, immünfloresan, immünohistokimya, akış sitometrisi, RNA ve protein ekstraksiyonu dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli downstream analizleri için kullanılabilir ve ilaç taraması için de değiştirilebilir. Bu sistemi bir platform olarak kullanarak tümör hücresi içsel ve tümör mikroortamındaki hücre ekstrensek değişikliklerinin tümör epitel mimarisini ve karsinom oluşumunu nasıl etkileyebildiği araştırılabilir.
