لقد قمنا بتطوير نموذج رواية 3D spheroids الذي يقدم منصة لدراسة التفاعلات السرطان stroma واختبار علاجات السرطان. في وجهة نظري، هذا النظام 3D يجمع بين الخلايا السرطانية في الخلايا الليفية stroma لمحاكاة أفضل ظروف الورم الحقيقي، ويمكن، لذلك، أن تكون أداة قوية جدا لاكتشاف المخدرات. بالإضافة إلى ذلك، لا يقتصر هذا النموذج على دراسة سرطان الجلد.
ويمكن استخدامه للتحقيق في أنواع أخرى من السرطانات. إثبات الإجراء سيكون الدكتور هونغوي شاو، وهو عالم كبير من مختبري. بالنسبة لثقافة خلايا سرطان الجلد البشري، قم برمي الخلايا في ظل ظروف ثقافة الخلايا التقليدية المتمسكة واكتمال W489 medium في 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
عندما تصل الخلايا إلى 90٪، تقسيم الخلايا إلى نسبة واحد إلى خمسة. لثقافة الماوس الجلد الليفي، وغسل الكريات الأنسجة المقطوعة في برنامج تلفزيوني قبل زراعة العينات وMM تكملها مع مصل الأبقار الجنينية 10 في المئة، وواحد في المئة البنسلين-ستريبتوميسين في حاضنة ثقافة الخلية. تقسيم الخلايا بنسبة واحد إلى اثنين عندما تصل إلى 90 في المئة التقاء.
قبل إعداد الثقافات المشتركة، والبذور الخلايا الليفية على طبق 100 ملليمتر في تركيز بحيث التقاء الخلية سوف تصل إلى ما يقرب من 60 في المئة في اليوم التالي. في صباح اليوم التالي، استبدل المابير بتركيز واحد إلى ثلاثة إلى واحد إلى خمسة من GFP إلى فيروس العدس المخفف من المخزون في وسط الثقافة العادية مع أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر من البوليبرين. ضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ست ساعات قبل استبدال المابير بثقافة جديدة.
بعد يومين، لاحظ إشارة GFP من الخلايا على مجهر الفلوريسنس. عندما تم نقل البيانات خلية كلا بشكل ثابت، فصل كلا الثقافات الخلية من 0.25 التربسين-EDTA لجمع تعليق خلية واحدة بواسطة الإرسالية. إعادة تعليق الخلايا في مرتين 10 إلى 4 الخلايا لكل ملليلتر من تركيز متوسطة الزراعة المشتركة وخلط خلايا الورم الميلانيني والأضام الليفية بنسبة واحد إلى واحد.
ثم انظر مليلترين من الخلايا إلى كل بئر من 24 لوحة بئر و33 مرة لكل حالة ووضع لوحة في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة أربع ساعات للسماح للخلايا إرفاق إلى أسفل لوحة. بالنسبة لثقافة الخلايا الميلانوما الفردية لتقييم تكوين عنقودية الخلايا 2D ، انظر مرتين 10 إلى خلايا سرطان الجلد الرابعة في كل بئر من 24 بئرًا والخلايا لثقافة لمدة سبعة إلى 10 أيام في حاضنة ثقافة الخلية. ثم تصوير الخلايا على مجهر الفلورانس المقلوب وفقا لبروتوكولات المجهر الفلورسنت القياسية.
إذا كان نظام التصوير الفاصل الزمني مطفأً، فُعرضه قبل ساعة واحدة على الأقل من التصوير. عندما يكون النظام جاهزاً، قم بنقل لوحة الثقافة بعناية إلى مرحلة المجهر وانزلاق الحاضنة وإغلاق الباب بشكل آمن. فتح برنامج نظام التصوير الفاصل الزمني وانقر فوق إضافة وعاء لتحديد نوع لوحة والشركة المصنعة حتى يتمكن المجهر من تحديد موقع منطقة المسح بدقة.
حدد عدسة 10 مرات الهدف والآبار من الفائدة وتعيين المعلمات لمنطقة المسح الضوئي، والوقت الفاصل بين المسح ووقت البدء والنهاية. ثم سجل التصوير الفاصل الزمني من أربع إلى 52 ساعة. في نهاية تسجيل الصور، استخدم برنامج نظام التصوير الفاصل الزمني لاسترداد البيانات وتصدير مقاطع الفيديو أو مجموعات الصور التي تم جمعها.
للتصوير المجهري confocal من الثقافات، ووضع لوحة على خشبة المسرح من المجهر المقلوب الفلوري واختيار أشعة الليزر الحمراء والخضراء. مراقبة الخلايا تحت هدف خمس أو عشر مرات وحدد spheroid لبدء المسح الضوئي. باستخدام خطوة واحدة ميكرون ض، مسح من أسفل إلى أعلى من spheroid.
ثم معالجة البيانات باستخدام برنامج معالجة الصور المناسبة لإعادة بناء صورة 3D التي يمكن أن تكون استدارة أكثر وحفظها كفيلم 3D. هنا، يتم عرض صور من 3D متعددة الخلايا التي شكلتها خلايا سرطان الجلد التكثر والالخلايا الليفية. خلايا الميلانوما المستزرعة في غياب الخلايا الليفية لا تشكل النماذج اللوئيدة 3D النموذجية، على الرغم من أن بعض خلايا سرطان الجلد تشكل مجموعات 2D مع ثقافة ممتدة.
باستخدام التصوير الفاصل الزمني، يمكن ملاحظة الخلايا الليفية والخلايا السرطانية تتفاعل في زراعة الخلايا، بدءا من الزاوي في حوالي 36 ساعة. في هذا الفيلم، يمكن ملاحظة العملية الديناميكية لتكوين خلية سرطان الميلانوما وحيد الثقافة من أربع إلى 52 ساعة من الثقافة. هنا ، يمكن ملاحظة بنية 3D spheroid عن طريق المجهر confocal بعد سبعة أيام من الثقافة ، بينما في هذا الفيلم ، يمكن تصور كتلة الخلايا 2D.
3D spheroids لا تزال معلقة في الثقافة المتوسطة والمتحركة، في حين أن مجموعات الخلايا الورمية 2D تميل إلى إرفاق لوحة الثقافة وغير متحركة. هذا النموذج 3D بمثابة منصة فريدة من نوعها لدراسة التفاعلات الورم stroma. على سبيل المثال، لتوضيح كيفية نشاط مسار إشارات Notch1 بين الخلايا والسرطان المرتبطة الخلايا الليفية بتنظيم الجذعية السرطانية وبدء تشكيل الخلايا والزفيرويد.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا النموذج لاختبار استجابات المخدرات من السرطان الجذعية والخلايا الشروع. على الرغم من أن هذا الأسلوب بسيط ومستقيم إلى الأمام، العناية باستخدام كثافة الخلية الصحيحة ونسبة الخلية، واستخدام لوحات الثقافة المناسبة كما هو موضح. ويمكن أيضا تطبيق هذا النموذج 3D إما لخلة تخدير حاسمة داخل الخلايا نشاط مسار إشارة لتحديد الأنماط الظاهرية للخلايا الجذعية السرطانية، فضلا عن فحص مركبات الجزيء الصغيرة التي الخلايا الجذعية السرطانية حساسة للغاية.
