Desenvolvemos um novo modelo de spheroids 3D que oferece uma plataforma para estudar interações câncer-estroma e testar terapêuticas cancerígenas. No meu ponto de vista, este sistema 3D combina células cancerígenas em um fibroblasto de estroma para melhor imitar condições genuínas do tumor e pode, portanto, ser uma ferramenta muito poderosa para a descoberta de drogas. Além disso, este modelo não se limita a estudar Melanoma.
Pode ser usado para investigar outros tipos de cânceres. Demonstrando o procedimento será o Dr. Hongwei Shao, um cientista sênior do meu laboratório. Para a cultura celular de melanoma humano, jogue as células sob condições convencionais de cultura celular aderente e complete o meio W489 a 37 graus celsius em 5% de dióxido de carbono.
Quando as células atingem 90% de confluência, divida as células em uma proporção de um a cinco. Para a cultura do fibroblasto da pele do camundongo, lave as pelotas de tecido colhido na PBS antes de cultivar os espécimes e o DMEM complementado com 10% de soro bovino fetal, e um por cento de penicilina-estreptomicina na incubadora de cultura celular. Divida as células em uma proporção de um para dois quando atingem uma confluência de 90%.
Antes de configurar as coculturas, os fibroblastos de sementes em uma antena de 100 milímetros em uma concentração de tal forma que a confluência celular atingirá aproximadamente 60% no dia seguinte. Na manhã seguinte, substitua o supernaente por uma concentração de um a três a um a cinco de GFP para lentivírus diluído do estoque em meio de cultura regular complementado com quatro microgramas por mililitro de polibrene. Coloque as células na incubadora de cultura celular por seis horas antes de substituir o supernascedor por meio de cultura fresca.
Após dois dias, observe o sinal GFP das células em um microscópio de fluorescência. Quando ambas as culturas celulares foram transfeinadas, desvincule ambas as culturas celulares de 0,25 trypsin-EDTA para coletar as suspensões de células únicas por centu navegação. Suspender as células em duas vezes 10 a 4 células por mililitro da concentração média da cocultura e misturar as células de melanoma e fibroblastos em uma proporção de um para um.
Em seguida, veja dois mililitros de células em cada poço de uma placa de 24 poços e triplicar para cada condição e colocar a placa na incubadora de cultura celular por quatro horas para permitir que as células se anexem ao fundo da placa. Para a cultura solo de células de melanoma para avaliar a formação de aglomerados de células 2D, consulte duas vezes 10 a quarta células de melanoma em cada poço de uma placa de 24 poços e cultua as células por sete a dez dias na incubadora de cultura celular. Em seguida, fotografe as células em um microscópio de fluorescência invertida de acordo com protocolos padrão de microscopia fluorescente.
Se o sistema de imagem de lapso de tempo estiver desligado, ligue-o pelo menos uma hora antes da imagem. Quando o sistema estiver pronto, transfira cuidadosamente a placa de cultura para o estágio do microscópio e deslize a incubadora e tranque a porta com segurança. Abra o software do sistema de imagem de lapso de tempo e clique em adicionar a nave para selecionar o tipo de placa e o fabricante para que o microscópio possa localizar a área de digitalização com precisão.
Selecione uma lente objetiva de 10 vezes e os poços de interesse e defina os parâmetros para a área de digitalização, o tempo de intervalo entre os scans e um tempo de partida e término. Em seguida, registo de imagem de lapso de tempo de quatro a 52 horas. No final da gravação de imagens, use o software do sistema de imagem de lapso de tempo para recuperar os dados e exportar os vídeos ou conjuntos de imagens coletados.
Para imagens de microscopia confocal das coculturas, coloque a placa no palco de um microscópio de fluorescência invertida e selecione os feixes de laser vermelho e verde. Observe as células sob um objetivo de cinco ou dez vezes e selecione o esferoide para iniciar a varredura. Usando um passo z de um míctico, escaneie de baixo para cima do esferoide.
Em seguida, processe os dados usando o software de processamento de imagem apropriado para reconstruir uma imagem 3D que pode ser mais rotacionada e salva como um filme 3D. Aqui, imagens de esferoides 3D multicelulares formados por células de melanoma coculturados e fibroblastos são mostrados. As células de melanoma cultivadas na ausência de fibroblastos não formam esferoides 3D típicos, embora algumas células de melanoma formem aglomerados 2D com cultura estendida.
Usando imagens de lapso de tempo, fibroblastos e células tumorais podem ser observados interagindo na cocultura, começando a partir de esferoides em cerca de 36 horas. Neste filme, pode-se observar o processo dinâmico de formação de células de melanoma de quatro a 52 horas de cultura. Aqui, uma estrutura esféide 3D pode ser observada por microscopia confocal após sete dias de cultura, enquanto neste filme, um aglomerado de células 2D pode ser visualizado.
Os esferoides 3D permanecem suspensos em meio de cultura e são móveis, enquanto os aglomerados de células tumorais 2D tendem a se anexar à placa de cultura e são imóveis. Este modelo 3D serve como uma plataforma única para estudar interações tumorais-estroma. Por exemplo, para elucidar como a atividade intercelular do Notch1 e os fibroblastos associados ao câncer regulam o caule do câncer e iniciam a formação celular e esferoide.
Além disso, este modelo pode ser usado para testar as respostas medicamentosas do câncer e células iniciantes. Embora este método seja simples e direto, tome cuidado para usar a densidade celular correta e a razão celular, e usar as placas de cultura apropriadas como demonstrado. Este modelo 3D também pode ser aplicado para sedação crucial atividade de sinalização intracelular para determinar os fenótipos de células-tronco cancerosas, bem como para triagem de pequenos compostos de moléculas para os quais as células-tronco cancerosas são altamente sensíveis.
