Wir haben ein neuartiges 3D-Sphäroidmodell entwickelt, das eine Plattform bietet, um Krebs-Stroma-Wechselwirkungen zu untersuchen und Krebstherapeutika zu testen. Aus meiner Sicht kombiniert dieses 3D-System Krebszellen in einem Stroma-Fibroblasten, um echte Tumorbedingungen besser nachzuahmen und kann daher ein sehr leistungsfähiges Werkzeug für die Entdeckung von Medikamenten sein. Darüber hinaus ist dieses Modell nicht auf die Untersuchung von Melanomen beschränkt.
Es kann verwendet werden, um andere Arten von Krebs zu untersuchen. Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Hongwei Shao, einem leitenden Wissenschaftler aus meinem Labor. Für die menschliche Melanom-Zellkultur, werfen Sie die Zellen unter konventionellen haftenden Zellkultur Bedingungen und vervollständigen W489 Medium bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid.
Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen, teilen Sie die Zellen im Verhältnis eins zu fünf auf. Für die Fibroblastenkultur der Maushaut waschen Sie die geernteten Gewebepellets in PBS, bevor Sie die Proben kultivieren und DMEM mit 10 Prozent fetalem Rinderserum und einem Prozent Penicillin-Streptomycin im Zellkultur-Inkubator ergänzen. Teilen Sie die Zellen im Verhältnis eins zu zwei auf, wenn sie eine Konfluenz von 90 Prozent erreichen.
Vor dem Aufbau der Kokulturen werden Die Saatfibroblasten in einer Konzentration auf eine 100-Millimeter-Schale aufgebracht, so dass die Zellkonfluency am nächsten Tag etwa 60 Prozent erreichen wird. Am nächsten Morgen, ersetzen Sie den Überstand durch eine Eins-zu-drei bis eins-fünf-Konzentration von GFP zu Lentivirus verdünnt aus Lager in regulären Kulturmedium mit vier Mikrogramm pro Milliliter Polybren ergänzt. Legen Sie die Zellen sechs Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator, bevor Sie den Überstand durch ein frisches Kulturmedium ersetzen.
Beobachten Sie nach zwei Tagen das GFP-Signal der Zellen auf einem Fluoreszenzmikroskop. Wenn beide Zellkulturen stabil transfiziert wurden, lösen Sie beide Zellkulturen von 0,25 Trypsin-EDTA, um die einzelzelligen Suspensionen durch Zentruvigation zu sammeln. Setzen Sie die Zellen mit einer zweifachen 10 bis vierten Zelle pro Milliliter der Cokulturmittelkonzentration aus und mischen Sie die Melanomzellen und Fibroblasten im Verhältnis eins zu eins.
Dann sehen Sie zwei Milliliter Zellen zu jedem Brunnen einer 24 Brunnenplatte und dreifach für jede Bedingung und legen Sie die Platte in der Zellkultur Inkubator für vier Stunden, damit die Zellen an der Platte unten zu befestigen. Für Melanom-Zell-Solokultur zur Bewertung der 2D-Zell-Clusterbildung, siehe zwei Mal 10 bis die vierte Melanom-Zellen in jedem Brunnen einer 24-Well-Platte und Kultur der Zellen für sieben bis zehn Tage im Zellkultur-Inkubator. Fotografieren Sie dann die Zellen auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop nach Standard-Fluoreszenzmikroskopieprotokollen.
Wenn das Zeitraffer-Bildgebungssystem ausgeschaltet ist, schalten Sie es mindestens eine Stunde vor der Bildgebung ein. Wenn das System fertig ist, übertragen Sie die Kulturplatte vorsichtig auf die Bühne des Mikroskops, schieben Sie den Inkubator und verriegeln Sie die Tür sicher. Öffnen Sie die Software des Zeitraffer-Bildgebungssystems und klicken Sie auf Behälter hinzufügen, um den Plattentyp und den Hersteller auszuwählen, damit das Mikroskop den Scanbereich genau lokalisieren kann.
Wählen Sie eine 10-fache Objektivlinse und die von Interesse interessierten Brunnen aus und legen Sie die Parameter für den Scanbereich, die Intervallzeit zwischen den Scans und eine Start- und Endzeit fest. Zeichnen Sie dann die Zeitraffer-Bildgebung von vier bis 52 Stunden auf. Verwenden Sie am Ende der Bildaufzeichnung die Software für das Zeitraffer-Bildgebungssystem, um die Daten abzurufen und die gesammelten Videos oder Bildsätze zu exportieren.
Für die konfokale Mikroskopie-Bildgebung der Kokulturen legen Sie die Platte auf die Bühne eines invertierten Fluoreszenzmikroskops und wählen Sie die roten und grünen Laserstrahlen aus. Beobachten Sie die Zellen unter einem fünf- oder zehnfachen Objektiv, und wählen Sie das Sphäroid aus, um mit dem Scannen zu beginnen. Mit einem Mikrometer-Z-Schritt scannen Sie von unten nach oben im Sphäroid.
Verarbeiten Sie die Daten dann mit der entsprechenden Bildverarbeitungssoftware, um ein 3D-Bild zu rekonstruieren, das weiter gedreht und als 3D-Film gespeichert werden kann. Hier werden Bilder von mehrzelligen 3D-Sphäroiden gezeigt, die durch kokultivierte Melanomzellen und Fibroblasten gebildet werden. Melanomzellen, die in Abwesenheit von Fibroblasten kultiviert werden, bilden keine typischen 3D-Sphäroide, obwohl einige Melanomzellen 2D-Cluster mit erweiterter Kultur bilden.
Mit Hilfe von Zeitraffer-Bildgebung können Fibroblasten und Tumorzellen beobachtet werden, die in der Kokultur interagieren, beginnend mit Sphäroiden nach etwa 36 Stunden. In diesem Film kann der dynamische Prozess der Bildung von Einzelkulturen der Melanomzellen bildung von vier bis 52 Stunden Kultur beobachtet werden. Hier kann eine 3D-Sphäroidstruktur durch konfokale Mikroskopie nach sieben Tagen Kultur beobachtet werden, während in diesem Film ein 2D-Zellcluster visualisiert werden kann.
3D-Sphäroide bleiben im Kulturmedium hängen und sind mobil, während 2D-Tumorzellencluster dazu neigen, sich an die Kulturplatte anzuheften und unbeweglich sind. Dieses 3D-Modell dient als einzigartige Plattform für die Untersuchung von Tumor-Stroma-Wechselwirkungen. Zum Beispiel zur Aufklärung, wie interzelluläre Notch1 Signalwegaktivität und Krebs assoziierte Fibroblasten den Stamm und die Entstehung von Krebszellen und Sphäroiden regulieren.
Darüber hinaus kann dieses Modell verwendet werden, um die Arzneimittelreaktionen von Krebsstamm und anitiierenden Zellen zu testen. Obwohl diese Methode einfach und geradlinig ist, achten Sie darauf, die richtige Zelldichte und das richtige Zellverhältnis zu verwenden und die entsprechenden Kulturplatten zu verwenden, wie gezeigt. Dieses 3D-Modell kann auch für die Sedierung wichtiger intrazellulärer Signalwegaktivitäten zur Bestimmung der Phänotypen von Krebsstammzellen sowie für das Screening kleiner Molekülverbindungen, auf die Krebsstammzellen hochempfindlich sind, angewendet werden.
