Biz kanser-stroma etkileşimleri çalışma ve kanser terapötik test etmek için bir platform sunan yeni bir 3D spheroids modeli geliştirdik. Benim bakış açıma göre, bu 3D sistem daha iyi gerçek tümör koşulları taklit etmek için bir stroma fibroblast kanser hücrelerini birleştirir ve bu nedenle, ilaç keşif için çok güçlü bir araç olabilir. Buna ek olarak, bu model Melanom çalışma ile sınırlı değildir.
Bu kanserlerin diğer türleri araştırmak için kullanılabilir. Prosedürü gösteren Dr. Hongwei Shao, laboratuvarımdan kıdemli bir bilim adamı. Insan melanom hücre kültürü için, konvansiyonel yapışık hücre kültürü koşulları altında hücreleri atmak ve tam W489 orta 37 santigrat derecede 5% karbondioksit.
Hücreler %90 birleştiğinde, hücreleri bir ila beş oranında bölün. Fare derisi fibroblast kültürü için, numuneleri toplamadan önce PBS'de hasat edilen doku peletlerini yıkayın ve dMEM yüzde 10 fetal sığır serumu ve hücre kültürü kuluçka makinesinde yüzde bir penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir. Hücreleri yüzde 90'lık bir araya geldiklerinde bire iki oranında bölün.
Kokültürleri kurmadan önce, tohum fibroblastları 100 milimetrelik bir tabağa öyle bir konsantrasyonla bağlanır ki hücre birleşmesi ertesi gün yaklaşık yüzde 60'a ulaşır. Ertesi sabah, normal kültür orta polibren başına dört mikrogram ile desteklenen stok seyreltilmiş lentivirus gfp bir-üç-bir-beş konsantrasyonu ile supernatant değiştirin. Taze kültür ortamı ile supernatant değiştirmeden önce altı saat boyunca hücre kültürü kuluçka içine hücreleri yerleştirin.
İki gün sonra, floresan mikroskobundaki hücrelerden gelen GFP sinyalini gözlemleyin. Her iki hücre kültürü de stfecably transfected olduğunda, centuvigation tarafından tek hücresüspansiyonları toplamak için 0.25 tripsin-EDTA her iki hücre kültürleri ayırın. Tekrar iki kez 10 dördüncü hücrelerde coculture orta konsantrasyon mililitre başına hücreleri askıya ve bire bir oranında melanom hücreleri ve fibroblastlar karıştırın.
Daha sonra her bir kuyuiçin iki mililitre hücre görün 24 kuyu plakave her durum için triplicate ve hücrelerin plaka altına takılması için dört saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesinde plaka yerleştirin. Melanom hücre yalnız kültür 2D hücre küme oluşumunu değerlendirmek için, iki kez bakın 10 bir 24 iyi plaka ve kültür hücre kültür kuluçka yedi ila 10 gün boyunca her kuyuiçine dördüncü melanom hücreleri. Daha sonra hücreleri standart floresan mikroskopi protokollerine göre ters floresan mikroskopta fotoğraflayın.
Zaman atlamalı görüntüleme sistemi kapalıysa, görüntülemeden en az bir saat önce açın. Sistem hazır olduğunda, kültür plakasını dikkatlice mikroskop aşamasına aktarın ve kuvöze kaydırın ve kapıyı güvenli bir şekilde kilitleyin. Zaman atlamalı görüntüleme sisteminin yazılımını açın ve plaka türünü ve üreticiyi seçmek için damar ekle'yi tıklatın, böylece mikroskop tarama alanını doğru bir şekilde bulabilir.
10 kat objektif lens ve ilgi kuyuları seçin ve tarama alanı için parametreleri ayarlayın, taramalar ve bir başlangıç ve bitiş süresi arasındaki aralık lı zaman. Sonra 4 ila 52 saat arasında zaman atlamalı görüntüleme kaydedin. Görüntü kaydının sonunda, verileri almak ve toplanan videoları veya görüntü kümelerini dışa aktarmak için zaman atlamalı görüntüleme sistemi yazılımını kullanın.
Kokültürlerin konfokal mikroskopi görüntülemesi için plakayı ters floresan mikroskobun sahnesine yerleştirin ve kırmızı ve yeşil lazer ışınlarını seçin. Beş veya 10 kat objektif altında hücreleri gözlemleyin ve tarama başlatmak için küresel seçin. Bir mikron z-adım kullanarak, küresel dibine kadar tazyik.
Daha sonra daha fazla döndürülebilir ve bir 3D film olarak kaydedilebilir bir 3D görüntü yeniden oluşturmak için uygun görüntü işleme yazılımı kullanarak verileri işlemek. Burada, cokültüre melanom hücreleri ve fibroblastlar tarafından oluşturulan çok hücreli 3D spheroidlerin görüntüleri gösterilmiştir. Fibroblastların yokluğunda kültürlenen melanom hücreleri tipik 3D spheroidler oluşturmaz, ancak bazı melanom hücreleri genişletilmiş kültüre sahip 2B kümeler oluştururlar.
Zaman atlamalı görüntüleme kullanılarak, fibroblastlar ve tümör hücreleri yaklaşık 36 saat tespüloidlerden başlayarak, kokültürde etkileşim gözlenebilir. Bu filmde, tek kültürlü melanom hücre agrega oluşumunun 4 ila 52 saatlik kültür oluşumunun dinamik süreci gözlemlenebilir. Burada, bir 3D küresel yapı kültür yedi gün sonra konfokal mikroskopi ile görülebilir, bu filmde ise, bir 2D hücre kümesi görselleştirilmiş olabilir.
3D küreseloidler kültür orta asılı kalır ve mobil, 2D tümör hücre kümeleri kültür plakası eklemek eğilimindedir ve hareketsiz iken. Bu 3D modeli tümör-stroma etkileşimleri incelemek için benzersiz bir platform olarak hizmet vermektedir. Örneğin, nasıl hücreler arası Notch1 sinyal yolu aktivitesi ve kanser ilişkili fibroblastlar kanser kök ve hücre ve küresel oluşumu nu başlatan düzenleyen açıklamak için.
Buna ek olarak, Bu model kanser kök ilaç yanıtlarını test etmek ve hücreleri başlatan için kullanılabilir. Bu yöntem basit ve yalındır olmasına rağmen, doğru hücre yoğunluğu nu ve hücre oranını kullanmaya ve gösterildiği gibi uygun kültür plakalarını kullanmaya özen gösterin. Bu 3D modeli aynı zamanda kanser kök hücrelerinin fenotiplerini belirlemek için önemli hücre içi sinyal yolu aktivitesini yatıştırmak ve kanser kök hücrelerinin son derece hassas olduğu küçük molekül bileşiklerinin taranması için de uygulanabilir.
