우리는 암 기질 상호 작용을 공부하고 암 치료제를 시험할 수있는 플랫폼을 제공하는 새로운 3D 스페로이드 모델을 개발했습니다. 내 관점에서, 이 3D 시스템은 더 나은 진짜 종양 조건을 모방하기 위하여 기질 섬유세포에 있는 암세포를 결합하고, 그러므로, 약 발견을 위한 아주 강력한 공구일 수 있습니다. 또한, 이 모델은 흑색종을 연구하는 데 만전을 기하지 않는다.
그것은 암의 그밖 모형을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 선임 과학자 인 Hongwei Shao 박사가 될 것입니다. 인간 흑색종 세포 배양을 위해, 기존의 부착 세포 배양 조건 하에서 세포를 던져 5%의 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 W489 배지를 완성한다.
세포가 90%의 합류에 도달하면 세포를 1 대 5 비율로 분할합니다. 마우스 피부 섬유아세포 배양의 경우, PBS에서 수확된 조직 펠릿을 세척한 후 표본을 배양하고 DMEM은 10%의 태아 소 혈청과 세포 배양 배양기에서 페니실린-연쇄 절제술을 보충합니다. 90%의 합류에 도달하면 세포를 일대일 비율로 분할합니다.
공동 문화를 설정하기 전에, 세포 합류가 다음 날 약 60 %에 도달 할 정도로 농도에서 100 밀리미터 접시에 섬유 아세포. 다음 날 아침, 상체를 폴리브레인 밀리리터 당 4 마이크로그램으로 보충된 일반 배양 배지의 재고에서 희석된 렌즈티바이러스에 GFP의 1대 3-5 농도로 대체한다. 상복부를 신선한 배양 배지로 대체하기 전에 세포를 세포 배양 인큐베이터에 6시간 동안 넣습니다.
이틀 후, 형광 현미경에 세포로부터 GFP 신호를 관찰한다. 두 세포 배양이 안정적으로 전염되었을 때, 두 세포 배양을 0.25 트립신-EDTA에서 분리하여 단일 세포 현탁액을 백분비화하여 수집한다. 다시 는 공동 배양 배지 농도의 밀리리터 당 2 회 10 ~ 4 세포에서 세포를 일시 중단하고 흑색종 세포와 섬유 아세포를 일대일 비율로 혼합한다.
그런 다음 각 조건에 대해 24 개의 우물 판과 삼중 판의 각 우물에 2 밀리리터의 세포를 보고 세포가 플레이트 바닥에 부착 할 수 있도록 4 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 흑색종 세포 솔로 배양의 경우 2D 세포 클러스터 형성을 평가하는 경우, 세포 배양기인큐베이터에서 7~10일 동안 세포를 배양하고 24개의 웰내로 각각 10~제4 흑색종 세포를 2회 참조한다. 그런 다음 표준 형광 현미경 프로토콜에 따라 반전된 형광 현미경으로 세포를 촬영합니다.
시간 경과 이미징 시스템이 꺼져 있으면 이미징 전에 적어도 한 시간 동안 켜십시오. 시스템이 준비되면 배양 판을 현미경의 단계로 조심스럽게 옮기고 인큐베이터를 밀어 도어를 단단히 잠급합니다. 시간 경과 이미징 시스템의 소프트웨어를 열고 선박을 클릭하여 플레이트 유형및 제조업체를 선택하여 현미경이 스캔 영역을 정확하게 찾을 수 있도록 합니다.
10배의 객관적인 렌즈와 관심 있는 우물을 선택하고 스캔 영역과 시작 및 종료 시간 사이의 간격 시간에 대한 매개 변수를 설정합니다. 그런 다음 4 시간에서 52 시간까지 시간 경과 이미징을 기록합니다. 이미지 녹화가 끝나면 시간 경과 이미징 시스템 소프트웨어를 사용하여 데이터를 검색하고 수집된 비디오 또는 이미지 세트를 내보냅니다.
동배의 공초점 현미경 이미징의 경우, 반전형 형광 현미경의 단계에 플레이트를 배치하고 빨간색과 녹색 레이저 빔을 선택합니다. 5 배 또는 10 배 목표하에서 세포를 관찰하고 스캐닝을 시작하는 스페로이드를 선택합니다. 하나의 미크론 z-스텝을 사용하여 스페로이드의 바닥에서 상단으로 스캔합니다.
그런 다음 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하여 3D 동영상으로 더 회전하고 저장할 수 있는 3D 이미지를 재구성합니다. 여기서, 공동 배양된 흑색종 세포및 섬유아세포에 의해 형성된 다세포 3D 스페로이드의 심상이 도시된다. 일부 흑색종 세포는 확장된 배양으로 2D 클러스터를 형성하더라도 섬유아세포가 없는 상태에서 배양된 흑색종 세포는 전형적인 3D 스페로이드를 형성하지 않습니다.
시간 경과 이미징을 사용하여 섬유아세포및 종양 세포는 약 36시간 에서 스페로이드에서 시작하여 공동 배양에서 상호 작용하는 것을 관찰할 수 있다. 본 영화에서, 단일 배양 흑색종 세포 응집 형성의 동적 과정을 4~52시간의 배양으로부터 관찰할 수 있다. 여기서, 3D 스페로이드 구조는 7일간의 배양 후 공초점 현미경검사법에 의해 관찰될 수 있으며, 이 영화에서는 2D 세포 클러스터가 시각화될 수 있다.
3D 스페로이드는 배양 배지에서 일시 중단된 상태로 유지되며 이동성이며, 2D 종양 세포 클러스터는 배양판에 부착되는 경향이 있으며 움직이지 않습니다. 이 3D 모델은 종양-스트로마 상호 작용을 연구하기위한 독특한 플랫폼역할을합니다. 예를 들면, 세포 간 Notch1 신호 통로 활동 및 암 관련 된 섬유아세포암암의 줄기 및 시동 세포 및 스페로이드 형성을 어떻게 해명.
또한, 이 모델은 암 줄기및 세포의 약물 반응을 시험하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 간단하고 직선이지만 올바른 세포 밀도 및 세포 비를 사용하고 입증 된 바와 같이 적절한 배양 판을 사용하십시오. 이 3D 모델은 또한 암 줄기 세포의 표현형을 결정하기 위한 중요한 세포내 신호 경로 활성을 진정시키고 암 줄기 세포가 매우 민감한 작은 분자 화합물을 선별하는 데 적용 될 수 있습니다.
