يصف هذا البروتوكول طريقة تركز على استخراج متوازيين أكثر مجموعات الخلايا الدبقية وفرة ، الأستروقراط و microglia ، من فئران ما بعد الولادة. تختلف طريقتنا عن غيرها من البروتوكولات التي سبق وصفها لعزلة الأسترويتي والميكروبليا لأننا نركز على الحصول على وعزل كلا النوعين من الخلايا في نفس الاستخراج بنفس الحالة ، وبالتالي تحسين استخدام الحيوانات التجريبية وتحسين دراسة الأدوار النسبية لهذه الخلايا في السياقات المناعية. يمكن أن يكون هذا البروتوكول مفيدًا لتحسين التحقيق في أدوار microglia و astrocyte في العديد من السياقات والأمراض في الجهاز العصبي المركزي مثل الزهايمر والشلل الرعاش والعدوى من قبل طفيليات أو فيروسات البروتوزوا على سبيل المثال.
الحصول على وعزل كلا النوعين من الخلايا من استخراج نفس من المستحسن لتقييم الدور المقارن لكل خلية فرعية سياقات المناعة مثل العدوى أو الالتهاب. يجب على الناس أن يكونوا حذرين خاصة أثناء إزالة الدماغ وغسل الأنسجة العصبية ، لكنني أعتقد أنه مع هذا البروتوكول والفيديو ، لن يكافح الناس. يمكن أن يكون هذا البروتوكول طويلا اعتمادا على عدد من الحيوانات لاستخراج الكورتيز حتى تكون على استعداد لقضاء حوالي أربع ساعات أو أكثر.
في اليوم الأول ، قم بإعداد HBSS و HBSS النقي بالإضافة إلى FBS المعطلة للحرارة بنسبة 10٪. تحضير DMEM F12 المكملة وتصفيتها بـ 0.22 ميكرون. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف واستخدام 70٪ الإيثانول أثناء العملية.
وضع الفئران حديثي الولادة في غرفة مختومة تحتوي على القطن غارقة مع ايزوفلوران لمدة خمس دقائق للتخدير العميق. رش الجرو الماوس مع 70٪ الإيثانول وقطع رأس الحيوان مع مقص. جعل قطع القوس مع مقص على طول الجمجمة لفتحه وفضح الدماغ.
إزالة الدماغ باستخدام ملعقة صغيرة للحفاظ على سلامة الدماغ. وضع الدماغ في طبق بيتري الجافة ستة سنتيمترات القطر. باستخدام ملعقة صغيرة، وإزالة لمبة الشم والمخيخ.
نقل القشرة إلى طبق بيتري آخر يحتوي على ملليلترين من HBSS بالإضافة إلى 10٪ FBS. قطع أنسجة الدماغ إلى قطع صغيرة مع مقص معقمة واستخدام p1000 micropipette، ونقل كل أنسجة الدماغ مع HBSS بالإضافة إلى 10٪ FBS إلى أنابيب مخروطية مختلفة 15 ملليلتر. إذا لزم الأمر، استخدم HBSS زائد 10٪ FBS لملء وحدة التخزين النهائية إلى ملليلترين.
غسل أنسجة المخ قطع مع ثلاثة ملليلترات من HBSS بالإضافة إلى 10٪ FBS لكل أنبوب. بعد decantation ، وإزالة بعناية فائقة. كرر الغسيل مع HBSS بالإضافة إلى 10٪ FBS ثلاث مرات إضافية.
ثم يغسل مع ثلاثة ملليلترات من HBSS نقية ثلاث مرات. بعد decantation ، وإزالة بعناية فائقة. بعد ذلك، أضف ثلاثة ملليلترات من التربسين ووضع الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تهز الأنابيب بلطف كل خمس دقائق.
هذا يهضم الأنسجة التي تم جمعها. تجنب الفقاعات. لإلغاء تنشيط التربسين، وغسل الأنسجة مع ثلاثة ملليلترات من HBSS زائد 10٪ FBS وبعد decantation من الأنسجة، وإزالة بعناية عظمى.
كرر هذا الغسيل ثلاث مرات. ثم غسل الأنسجة مع ثلاثة ملليلتر من HBSS نقية وكرر مرتين إضافيتين. بعد إزالة الأنسجة ، وإزالة بعناية عظمى.
إضافة سبعة ملليلتر من HBSS نقية وتجانس الأنسجة من خلال ممرات متتالية في الماصات، أولا مع ماصة مصلية ملليلتر 10، تليها ماصة خمسة ملليلتر، وأخيرا مع p1000 ميكروبيبيت. وبعد التجانس، تعمل أجهزة الطرد المركزي على 450 مرة ز لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تجاهل افراط و resuspend بيليه مع أربعة ملليلتر من HBSS بالإضافة إلى 10٪ FBS لكل أنبوب.
نقل الخلايا إلى قارورة T75 المعالجة تجارياً من أجل التصاق ثقافة الخلية الأمثل. ضع القارورة في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية بمعدل 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة للتقيد بها. ثم إضافة 10 ملليلتر من DMEM F12 مكملة إلى قارورة واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ليلتين.
في اليوم الثالث، قم بإزالة سبعة ملليلترات من متوسط الثقافة من قارورة T75 وإضافة سبعة ملليلترات من DMEM F12 الطازجة المكملة. أعيدي القارورة إلى الحاضنة. في اليوم الخامس، لإزالة الحطام والخلايا غير المُصمّم، تبادل كل الوسط من قارورة T75 مع 14 ملليلتر من DMEM F12 الطازجة المكملة.
ثم كل 48 ساعة، وإزالة ستة ملليلتر من عظمى وإضافة سبعة ملليلتر من جديد مكملة DMEM F12 المتوسطة حتى اليوم 14 من الثقافة. في اليوم 14، بعد إزالة ستة ملليلترات من السوبر وإضافة سبعة ملليلتر من الطازجة تكمل DMEM F12 المتوسطة، وإغلاق قارورة T75 بإحكام مع التفاف البلاستيك. وضعها في اكر الكلمة المدارية في 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتكف ميكانيكيا microglia من الخلايا الفلكية.
في اليوم 15، واتخاذ القارورة من شاكر وغسلها بقوة مع المتوسطة الخاصة بهم من أجل تحسين تفكك الخلية وحصاد الحد الأقصى لعدد من microglia. ثم جمع افرا ونقله إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. بعد ذلك، أضف أربعة ملليلترات من التربسين إلى كل قارورة واحتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية من أجل فصل الخلايا الفلكية.
ثم إضافة خمسة ملليلتر من DMEM F12 مكملة لإلغاء تنشيط التربسين. اغسل القارورة بوسيطها الخاص ونقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي جميع الأنابيب التي تحتوي على ميكروجليا أو الخلايا الفلكية المتفككة في 450 مرات ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
تجاهل المُندفع. Resuspend بيليه microglia في ملليلتر واحد من DMEM F12 المكملة وatrocytes في 10 ملليلتر من DMEM F12 المكملة. تابع إلى عد الخلايا في غرفة Neubauer أو عداد خلية تلقائية.
لوحة الخلايا مع DMEM F12 مكملة في الكثافة المطلوبة في صفيحة ثقافة الخلية السفلية المسطحة مسبقة المعالجة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة للسماح لهم بالتعلق. في اليوم الرابع عشر، خضعت ثقافة الخلايا الدبقية للانفصام الميكانيكي.
هو كان لاحظت مع نقاء من 89.5٪ ل الالسّكان [أستروسيت] و96.6٪ ل ال [ميكروغليا] سكّكان. أُصيبت الخلايا الفلكية والميكرة الغليلية من فئران C57BL6 بـ T.cruzi Y.After ساعتين و48 ساعة و96 ساعة، تم إصلاح الغرف بالميثانول والملطخة بعلامة الخلايا النوى DAPI ومضادة لـ GFAP. وقد حسن استخدام الطفيليات المعدلة وراثياً التي تعبر عن المراسلين الفلورسنتين أو الطفيليات التي تحمل علامات على أجسام مضادة فلورية محددة مجهرية الفلوروسنس لأنها تتميز بشكل أفضل عن نواة الخلية.
ويرد هنا مثالان. T.gondii RH سلالة التعبير عن YFP و T.cruzi Y سلالة ملطخة غير التجارية أحادية النسيلة الأجسام المضادة 2C2 المضادة للبروتين SSP4. من المهم غسل الخلايا بعناية حتى لا تفقد أي مجاميع الخلايا.
بعد عدوى الخلايا الدبقية، يمكن تقييم المعلمات الأخرى مثل ELISA لإنتاج السيتوكين الموجودة في غلوانت، غربية من النشاف للتعبير البروتيني، وفي الوقت الحقيقي PCR الكمية لتقييم النسخ RNA. العديد من الأسئلة المتعلقة بوظيفة الخلايا الدبقية، على سبيل المثال عملية التمثيل الغذائي، والاستجابة المناعية، وبيولوجيا الخلايا نفسها يمكن معالجتها والاستفادة من هذه التقنية. جميع الطفيليات البروتوزوا قادرة على إصابة الخلايا البشرية وكذلك خلايا الماوس ثقافة لذلك من المهم أن نكون حذرين عند التعامل مع هذا الطفيلي.
