Este protocolo describe un método que se centra en extraer en paralelo las dos poblaciones de células gliales más abundantes, astrocitos y microglia, de ratones postnatales. Nuestro método se diferencia de otros protocolos previamente descritos para el aislamiento de astrocitos y microglia porque nos centramos en obtener y aislar ambos tipos celulares en la misma extracción en la misma condición, optimizando así el uso de animales experimentales y mejorando el estudio de roles relativos para estas células en contextos inmunológicos. Este protocolo puede ser útil para investigar mejor los roles de microglia y astrocitos en muchos contextos y enfermedades en el sistema nervioso central como el Alzheimer, el Parkinson y las infecciones por ejemplo protozoos parásitos o virus.
Es deseable obtener y aislar ambos tipos de células de la misma extracción para evaluar el papel comparativo de cada subconjunto celular de contextos inmunológicos como la infección o la inflamación. La gente debe tener cuidado especialmente durante la extirpación del cerebro y lavados de tejido nervioso, pero creo que con este protocolo y la toma de vídeo, la gente no tendrá problemas. Este protocolo puede ser largo dependiendo del número de animales para extraer los cortices así que prepárate para pasar unas cuatro horas o más.
En el primer día, prepare HBSS y HBSS puros más 10% FBS inactivados por calor. Prepare DMEM F12 suplementado y filtre con un filtro de 0,22 micras. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en un autoclave y utilice 70% de etanol durante el procedimiento.
Poner ratones recién nacidos en una cámara sellada que contenga algodón empapado con isoflurano durante cinco minutos para anestesia profunda. Rocía el cachorro de ratón con 70%etanol y decapita al animal con tijeras. Haz un corte sagital con tijeras a lo largo del cráneo para abrirlo y exponer el cerebro.
Retire el cerebro usando una micro espátula para mantener la integridad cerebral. Coloque el cerebro en un plato seco de seis centímetros de diámetro. Con una micro espátula, retire el bulbo olfativo y el cerebelo.
Mueva la corteza a otra placa de Petri que contenga dos mililitros de HBSS más 10%FBS. Cortar el tejido cerebral en trozos pequeños con tijeras estériles y usando una micropipeta P1000, transferir cada tejido cerebral con HBSS más 10%FBS a diferentes tubos cónicos de 15 mililitros. Si es necesario, utilice HBSS más 10%FBS para llenar el volumen final a dos mililitros.
Lave el tejido cerebral cortado con tres mililitros de HBSS más 10%FBS para cada tubo. Después de la decantación, retire cuidadosamente el sobrenadante. Repita el lavado con HBSS más 10%FBS tres veces más.
A continuación, lave con tres mililitros de HBSS puro tres veces. Después de la decantación, retire cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, agregue tres mililitros de trippsina y coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 30 minutos agitando suavemente los tubos cada cinco minutos.
Esto digiere el tejido recogido. Evita las burbujas. Para inactivar la tripina, lave el tejido con tres mililitros de HBSS más 10%FBS y después de la decantación del tejido, retire cuidadosamente el sobrenadante.
Repita este lavado tres veces. A continuación, lave el tejido con tres mililitros de HBSS puro y repita dos veces adicionales. Después de la decantación del tejido, retire cuidadosamente el sobrenadante.
Añadir siete mililitros de HBSS puro y homogeneizar el tejido a través de pasajes sucesivos en pipetas, primero con una pipeta serológica de 10 mililitros, seguida de una pipeta de cinco mililitros, y finalmente con una micropipeta P1000. Después de la homogeneización, centrifugar los tubos a 450 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet con cuatro mililitros de HBSS más 10%FBS para cada tubo.
Transfiera las células a un matraz T75 pretratado comercialmente para una adhesión óptima al cultivo celular. Coloque el matraz en una incubadora a 37 grados centígrados al 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos para su adherencia. A continuación, añadir 10 mililitros de DMEM F12 suplementado al matraz e incubar a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante dos noches.
En el tercer día, retire siete mililitros de medio de cultivo del matraz T75 y agregue siete mililitros de DMEM F12 con suplemento fresco. Devuelva el matraz a la incubadora. En el día cinco, para eliminar escombros y células no adherentes, cambie todo el medio del matraz T75 con 14 mililitros de DMEM F12 fresco suplementado.
Luego, cada 48 horas, retire seis mililitros del sobrenadante y agregue siete mililitros de nuevo suplemento DMEM F12 medio hasta el día 14 de cultivo. En el día 14, después de retirar seis mililitros de sobrenadante y añadir siete mililitros de medio DMEM F12 fresco suplementado, cierre los matraces T75 firmemente con envoltura de plástico. Colóquelos en el agitador orbital del suelo a 200 RPM y 37 grados Celsius durante la noche para disociar mecánicamente la microglia de los astrocitos.
El día 15, tome los matraces de la coctelera y lávelos vigorosamente con su propio medio para optimizar la disociación celular y cosechar el máximo número de microglia. A continuación, recoja el sobrenadante y transfiéralo a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, añadir cuatro mililitros de trippsina a cada matraz e incubar durante cinco minutos a 37 grados Celsius con el fin de separar los astrocitos.
A continuación, agregue cinco mililitros de DMEM F12 suplementado para inactivar la trippsina. Lave los frascos con su propio medio y transfiera el contenido a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar todos los tubos que contengan microglia disociada o astrocitos a 450 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet de microglia en un mililitro de DMEM F12 suplementado y los astrocitos en 10 mililitros de DMEM F12 suplementado. Proceda al conteo celular en una cámara Neubauer o en un contador automático de celdas.
Placar las células con DMEM F12 suplementado en la densidad deseada en una placa de cultivo celular inferior plana pretratada. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas para permitir que se adhieran. En el día 14, el cultivo celular glial se sometió a una disociación mecánica.
Se observó con una pureza del 89,5% para la población de astrocitos y del 96,6% para la población de microglia. Los astrocitos y la microglia de los ratones C57BL6 se infectaron con T.cruzi Y.Después de dos horas, 48 horas y 96 horas, las cámaras se fijaron con metanol y se tiñeron con el marcador de nucleasa celular DAPI y anti-GFAP. El uso de parásitos modificados genéticamente que expresan reporteros fluorescentes o parásitos etiquetados con anticuerpos fluorescentes específicos mejoró la microscopía de inmunofluorescencia, ya que se distinguen mejor del núcleo celular.
Aquí se presentan dos ejemplos. T.gondii RH cepa que expresa constitutivamente YFP y T.cruzi Y cepa teñida con anticuerpo monoclonal no comercial 2C2 anti-SSP4 proteína. Es importante lavar cuidadosamente las células para no perder ningún agregado celular.
Después de la infección de las células gliales, se pueden evaluar otros parámetros como ELISA para la producción de citoquinas presente en el sobrenadante, la hinchazón occidental para la expresión de proteínas y la PCR cuantitativa en tiempo real para la evaluación de la transcripción del ARN. Muchas preguntas relacionadas con la función de las células gliales, por ejemplo su metabolismo, la respuesta inmunitaria y la biología celular en sí pueden ser abordadas y beneficiadas por esta técnica. Todos los parásitos protozoos son capaces de infectar las células humanas, así como las células del ratón de cultivo por lo que es importante tener cuidado al manejar este parásito.
