Bu protokol, doğum sonrası farelerden en çok bulunan iki glial hücre popülasyonu olan astrosit ve mikroglia'ya paralel olarak ayıklama üzerine odaklanan bir yöntemi açıklamaktadır. Yöntemimiz, astrosit ve mikroglia izolasyonu için daha önce tanımlanmış protokollerden farklıdır, çünkü her iki hücre tipini de aynı koşulda elde edip izole etme, böylece deneysel hayvanların kullanımını optimize etme ve bu hücreler için immünolojik bağlamlarda göreceli rollerin incelenmesini iyileştirmeye odaklanırız. Bu protokol, örneğin protozoa parazitleri veya virüsleri tarafından merkezi sinir sisteminde ki birçok bağlamda ve hastalıklarda mikroglia ve astrosit rollerinin daha iyi araştırılması için yararlı olabilir.
Her iki hücre tipinin de aynı ekstraksiyondan elde edilmesi ve izole edilmesi, enfeksiyon veya inflamasyon gibi her hücre alt kümesinin immünolojik bağlamlarının karşılaştırmalı rolünü değerlendirmek için istenir. İnsanlar özellikle beyin kaldırma ve sinir dokusu yıkar sırasında dikkatli olmalıdır, ama bu protokol ve video çekim ile, insanlar mücadele olmaz inanıyorum. Bu protokol, yaklaşık dört saat veya daha fazla harcamaya hazır olmak bu yüzden korteksleri ayıklamak için hayvan sayısına bağlı olarak uzun olabilir.
İlk gün, saf HBSS ve HBSS artı% 10 ısı-inaktive FBS hazırlayın. Eklenmiş DMEM F12 hazırlayın ve 0,22 mikron filtre ile filtreleyin. Bir otoklav tüm cerrahi aletleri sterilize ve işlem sırasında% 70 etanol kullanın.
Derin anestezi için beş dakika boyunca isofluran ile ıslatılmış pamuk içeren kapalı bir odaya yeni doğan fareler koyun. Sprey fare yavrusu% 70 etanol ile ve makas ile hayvan decapitate. Açmak ve beyin ortaya çıkarmak için kafatası boyunca makas ile bir sagittal kesim olun.
Beyin bütünlüğünü korumak için bir mikro spatula kullanarak beyin çıkarın. Kuru altı santimetre çapında Petri çanak beyin yerleştirin. Bir mikro spatula kullanarak, koku ampul ve beyincik kaldırın.
Korteksi iki mililitre HBSS artı %10 FBS içeren başka bir Petri kabına taşıyın. Steril makas ile küçük parçalar halinde beyin dokusu kesin ve bir P1000 mikropipet kullanarak, farklı 15 mililitre konik tüpler için HBSS artı% 10 FBS ile her beyin dokusu transfer. Gerekirse, son hacmi iki mililitreye doldurmak için HBSS artı %10 FBS kullanın.
Kesilen beyin dokusunu üç mililitre HBSS artı her tüp için %10 FBS ile yıkayın. Dekantasyondan sonra, supernatant'ı dikkatlice çıkarın. HBSS artı %10 FBS ile yıkamayı üç kez daha tekrarlayın.
Sonra üç kez saf HBSS üç mililitre ile yıkayın. Dekantasyondan sonra, supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Sonra, tripsin üç mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece bir su banyosunda tüp yerleştirin 30 dakika yavaşça her beş dakikada tüplersal sallayarak.
Bu toplanan dokuyu sindirir. Kabarcıklar kaçının. Tripsin inaktive etmek için, HBSS üç mililitre artı% 10 FBS ile doku yıkayın ve doku decantation sonra, dikkatle supernatant çıkarın.
Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. Sonra saf HBSS üç mililitre ile doku yıkayın ve iki kez daha tekrarlayın. Doku decantation sonra, dikkatle supernatant çıkarın.
Saf HBSS yedi mililitre ekleyin ve pipetler ardışık pasajlar yoluyla doku homojenize, bir 10 mililitre serolojik pipet ile ilk, beş mililitrelik pipet takip, ve son olarak bir P1000 mikropipet ile. Homojenizasyondan sonra tüpleri 450 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve her tüp için HBSS artı% 10 FBS dört mililitre ile pelet resuspend.
En iyi hücre kültürü yapışması için hücreleri ticari olarak önceden işlenmiş bir T75 şişesine aktarın. Şişeyi 37 derecede bir kuvöze yerleştirin ve yapışma için %5 karbondioksit verin. Daha sonra şişeye 10 mililitre dMEM F12 ekleyin ve iki gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve %5 karbondioksit ekleyin.
Üçüncü gün, T75 şişesinden yedi mililitre kültür ortamını çıkarın ve yedi mililitre taze takviyeli DMEM F12 ekleyin. Şişeyi kuvöze geri ver. Beşinci gün, enkaz ve yapışmaz hücreleri kaldırmak için, taze takviye DMEM F12 14 mililitre ile T75 şişesi tüm orta değişimi.
Sonra her 48 saatte bir, supernatant altı mililitre çıkarın ve kültür gün 14 kadar taze takviye DMEM F12 orta yedi mililitre ekleyin. Gün 14, supernatant altı mililitre kaldırarak ve taze takviye DMEM F12 orta yedi mililitre ekledikten sonra, plastik ambalaj ile sıkıca T75 şişeleri kapatın. Astrositlerden mikrogliayı mekanik olarak ayrıştırmak için bir gecede 200 RPM ve 37 santigrat derecede yer orbital shaker'ına yerleştirin.
15. günde, şişeleri çalkalayıcıdan alın ve hücre ayrışmasını optimize etmek ve maksimum mikroglia sayısını hasat etmek için kendi ortamlarıyla şiddetle yıkayın. Sonra supernatant toplamak ve 50 mililitrekonik tüp aktarın. Sonra, her şişeye dört mililitre tripsin ekleyin ve astrositleri ayırmak için 37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın.
Sonra tripsin inaktive etmek için eklenmiş DMEM F12 beş mililitre ekleyin. Şişeleri kendi ortamlarıyla yıkayın ve içindekileri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. 450 kez g dört santigrat derecede beş dakika boyunca ayrıştırılmış mikroglia veya astrosit içeren tüm tüpleri santrifüj.
Supernatant atın. Tamamlanmış DMEM F12'nin bir mililitresinde mikroglia peletini ve 10 mililitre lik eklenmiş DMEM F12'deki astrositleri yeniden askıya alın. Neubauer odasında veya otomatik hücre sayacında hücre saymaya devam edin.
Önceden işlenmiş düz alt hücre kültür plakasında istenilen yoğunlukta tamamlayıcı DMEM F12 ile hücreleri plakalayın. Hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın. 14. günde glial hücre kültürü mekanik dissociasyona uğramıştır.
Astrosit popülasyonu %89.5, mikroglia popülasyonu %96.6 saflıkta gözlendi. C57BL6 farelerinden gelen astrositler ve mikroglialar T.cruzi Y.'ye iki saat, 48 saat ve 96 saat sonra metanol ile sabitlenmiş ve hücre çekirdeği belirteci DAPI ve anti-GFAP ile boyanmıştır. Floresan muhabirleri veya spesifik floresan antikorlarla etiketlenmiş parazitleri ifade eden genetiği değiştirilmiş parazitlerin kullanımı, hücre çekirdeğinden daha iyi ayırt edildikleri için immünoresans mikroskobunu iyileştirmiştir.
Burada iki örnek sunulmuştur. T.gondii RH suş uvelek, ticari olmayan monoklonal antikor 2C2 anti-SSP4 proteini ile lekelenmiş YFP ve T.cruzi Y suşunu oluşturan bir şekilde ifade edilir. Herhangi bir hücre agregaları kaybetmemek için hücreleri dikkatle yıkamak önemlidir.
Glial hücre enfeksiyonundan sonra, supernatant'ta bulunan sitokin üretimi için ELISA, protein ekspresyonu için Western blotting ve RNA transkripsiyon değerlendirmesi için gerçek zamanlı kantitatif PCR gibi diğer parametreler değerlendirilebilir. Glial hücrelerin işlevi ile ilgili birçok soru, örneğin metabolizma, bağışıklık yanıtı, ve hücre biyolojisi kendisi ele alınabilir ve bu teknik ten yararlanabilir. Tüm protozoa parazitleri insan hücrelerinin yanı sıra kültür fare hücreleri enfekte edebiliyoruz bu yüzden bu parazit ele ederken dikkatli olmak önemlidir.
