Ce protocole décrit une méthode qui est axée sur l’extraction en parallèle des deux populations de cellules gliales les plus abondantes, les astrocytes et les microglies, à partir de souris postnatales. Notre méthode diffère des autres protocoles précédemment décrits pour l’isolement des astrocytes et des microglies parce que nous nous concentrons sur l’obtention et l’isolement des deux types de cellules dans la même extraction à la même condition, optimisant ainsi l’utilisation d’animaux expérimentaux et améliorant l’étude des rôles relatifs pour ces cellules dans des contextes immunologiques. Ce protocole peut être utile pour mieux étudier les rôles des microglies et des astrocytes dans de nombreux contextes et maladies du système nerveux central tels que la maladie d’Alzheimer, Parkinson et les infections par exemple les parasites ou les virus protozoaires.
L’obtention et l’isolement des deux types de cellules à partir de la même extraction sont souhaitables pour évaluer le rôle comparatif de chaque cellule sous-ensemble contextes immunologiques tels que l’infection ou l’inflammation. Les gens devraient être prudents en particulier lors de l’ablation du cerveau et des lavages de tissus nerveux, mais je crois qu’avec ce protocole et la vidéo tournée, les gens ne lutteront pas. Ce protocole peut être long en fonction du nombre d’animaux pour extraire les cortices alors soyez prêt à passer environ quatre heures ou plus.
Le premier jour, préparez du HBSS pur et du HBSS plus 10 % de FBS inactivé par la chaleur. Préparez le DMEM F12 complété et filtrez-le avec un filtre de 0,22 micron. Stériliser tous les instruments chirurgicaux dans un autoclave et utiliser 70% d’éthanol pendant l’intervention.
Mettez les souris nouveau-nées dans une chambre scellée contenant du coton imbibé d’isoflurane pendant cinq minutes pour une anesthésie profonde. Vaporiser le chiot de souris avec 70% d’éthanol et décapiter l’animal avec des ciseaux. Faire une coupe sagittale avec des ciseaux le long du crâne pour l’ouvrir et exposer le cerveau.
Retirez le cerveau à l’aide d’une micro spatule pour maintenir l’intégrité du cerveau. Placer le cerveau dans une boîte de Pétri sèche de six centimètres de diamètre. À l’aide d’une micro spatule, retirer l’ampoule olfactive et le cervelet.
Déplacez le cortex vers une autre boîte de Pétri contenant deux millilitres de HBSS plus 10%FBS. Couper le tissu cérébral en petits morceaux avec des ciseaux stériles et à l’aide d’une micropipette P1000, transférer chaque tissu cérébral avec HBSS plus 10%FBS à différents tubes coniques de 15 millilitres. Si nécessaire, utilisez HBSS plus 10%FBS pour remplir le volume final à deux millilitres.
Lavez le tissu cérébral coupé avec trois millilitres de HBSS plus 10%FBS pour chaque tube. Après la décantation, retirer soigneusement le surnatant. Répétez le lavage avec HBSS plus 10%FBS trois fois supplémentaires.
Puis laver avec trois millilitres de HBSS pur trois fois. Après la décantation, retirer soigneusement le surnatant. Ensuite, ajoutez trois millilitres de trypsine et placez le tube dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en secouant doucement les tubes toutes les cinq minutes.
Cela digère les tissus recueillis. Évitez les bulles. Pour inactiver la trypsine, lavez le tissu avec trois millilitres de HBSS plus 10%FBS et après décantation du tissu, retirez soigneusement le supernatant.
Répétez ce lavage trois fois. Ensuite, lavez le tissu avec trois millilitres de HBSS pur et répétez deux fois supplémentaires. Après décantation du tissu, retirer soigneusement le surnatant.
Ajouter sept millilitres de HBSS pur et homogénéiser le tissu à travers des passages successifs en pipettes, d’abord avec une pipette sérologique de 10 millilitres, suivie d’une pipette de cinq millilitres, et enfin avec une micropipette P1000. Après homogénéisation, centrifuger les tubes à 450 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille avec quatre millilitres de HBSS plus 10%FBS pour chaque tube.
Transférer les cellules dans un flacon T75 prétraité commercialement pour une adhérence optimale à la culture cellulaire. Placez le flacon dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes pour l’observance. Ajoutez ensuite 10 millilitres de DMEM F12 complété au flacon et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux nuits.
Le troisième jour, retirez sept millilitres de milieu de culture du flacon T75 et ajoutez sept millilitres de DMEM F12 fraîchement complété. Remettre le flacon à l’incubateur. Le cinquième jour, pour enlever les débris et les cellules non adhérentes, échangez tout le milieu de la fiole T75 avec 14 millilitres de DMEM F12 fraîchement complété.
Puis toutes les 48 heures, retirer six millilitres du supernatant et ajouter sept millilitres de DMEM F12 frais complété moyen jusqu’au jour 14 de la culture. Le jour 14, après avoir enlevé six millilitres de supernatant et ajouté sept millilitres de milieu DMEM F12 frais complété, fermez les flacons T75 hermétiquement avec un emballage en plastique. Placez-les dans le shaker orbital de plancher à 200 RPM et 37 degrés Celsius pendant la nuit pour dissocier mécaniquement les microglies des astrocytes.
Le jour 15, prenez les flacons du shaker et lavez-les vigoureusement avec leur propre milieu afin d’optimiser la dissociation cellulaire et de récolter le nombre maximum de microglies. Puis recueillir le supernatant et le transférer dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, ajouter quatre millilitres de trypsine à chaque flacon et incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius afin de détacher les astrocytes.
Ajouter ensuite cinq millilitres de DMEM F12 complété pour inactiver la trypsine. Laver les flacons avec leur propre milieu et transférer le contenu dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugeuse tous les tubes contenant des microglies ou des astrocytes dissociés à 450 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Jeter le surnatant. Resuspendez la pastille de microglie dans un millilitre de DMEM F12 complété et les astrocytes dans 10 millilitres de DMEM F12 complété. Procéder au comptage cellulaire dans une chambre Neubauer ou un compteur de cellules automatique.
Plaquez les cellules avec le DMEM F12 complété à la densité désirée dans une plaque plate prétraitée de culture de cellules de fond plat. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures pour leur permettre de s’attacher. Le 14ème jour, la culture glial de cellules a subi la dissociation mécanique.
Il a été observé avec une pureté de 89,5% pour la population d’astrocytes et de 96,6% pour la population de microglies. Les astrocytes et les microglies des souris C57BL6 ont été infectés par T.cruzi Y.After deux heures, 48 heures, et 96 heures, les chambres ont été fixées avec le méthanol et tachées avec le marqueur de nucléase cellulaire DAPI et anti-GFAP. L’utilisation de parasites génétiquement modifiés exprimant des reporters fluorescents ou des parasites étiquetés avec des anticorps fluorescents spécifiques a amélioré la microscopie d’immunofluorescence puisqu’ils sont mieux distingués du noyau cellulaire.
Deux exemples sont présentés ici. La souche T.gondii RH exprimant constitutivement la souche YFP et T.cruzi Y tachée d’anticorps monoctone non commercial 2C2 anti-SSP4. Il est important de laver soigneusement les cellules pour ne pas perdre d’agrégats cellulaires.
Après l’infection de cellules gliales, d’autres paramètres peuvent être évalués tels que ELISA pour la production de cytokine présente dans le supernatant, ballonnement occidental pour l’expression de protéine, et PCR quantitatif en temps réel pour l’évaluation de transcription d’ARN. De nombreuses questions liées à la fonction des cellules gliales, par exemple leur métabolisme, leur réponse immunitaire et la biologie cellulaire elle-même peuvent être abordées et bénéficier de cette technique. Tous les parasites protozoaires sont capables d’infecter les cellules humaines ainsi que les cellules de souris de culture, il est donc important d’être prudent lors de la manipulation de ce parasite.
