פרוטוקול זה מתאר שיטה המתמקדת בחילוץ במקביל לשתי אוכלוסיות תאי הגלייה הנפוצות ביותר, אסטרוציטים ומיקרוגליה, מעכברים לאחר לידה. השיטה שלנו שונה מאחרים שתוארו בעבר פרוטוקולים לבידוד אסטרוציטים ומיקרוגליה מכיוון שאנו מתמקדים בהשגת ובידוד שני סוגי התאים באותו חילוץ באותו מצב, ובכך לייעל את השימוש בבעלי חיים ניסיוניים ולשפר את המחקר של תפקידים יחסיים עבור תאים אלה בהקשרים אימונולוגיים. פרוטוקול זה יכול להיות שימושי עבור טוב יותר לחקור microglia ותפקידי אסטרוציטים בהקשרים רבים ומחלות במערכת העצבים המרכזית כגון אלצהיימר, פרקינסון, וזיהומים על ידי למשל טפילי פרוטוזואה או וירוסים.
קבלת ובידול שני סוגי התאים מאותו מיצוי רצוי להעריך את התפקיד היחסי של כל תת-קבוצה של תא הקשרים אימונולוגיים כגון זיהום או דלקת. אנשים צריכים להיות זהירים במיוחד במהלך הסרת המוח ורקמות עצבים שוטף, אבל אני מאמין כי עם פרוטוקול זה ואת הווידאו ירה, אנשים לא ייאבקו. פרוטוקול זה יכול להיות ארוך בהתאם למספר בעלי החיים כדי לחלץ את קליפת המוח כדי להיות מוכנים לבלות כארבע שעות או יותר.
ביום הראשון, הכינו HBSS ו-HBSS טהורים ועוד 10% FBS מושבת בחום. הכן DMEM F12 בתוספת ולסנן אותו עם מסנן 0.22 מיקרון. לעקר את כל המכשירים הכירורגיים autoclave ולהשתמש 70% אתנול במהלך ההליך.
שים עכברים שזה עתה נולדו בתא אטום המכיל כותנה ספוגה isoflurane במשך חמש דקות להרדמה עמוקה. לרסס את גור העכבר עם 70% אתנול לערוף את החיה עם מספריים. בצע חתך קשתי עם מספריים לאורך הגולגולת כדי לפתוח אותו ולחשוף את המוח.
הסר את המוח באמצעות מרית מיקרו כדי לשמור על שלמות המוח. מניחים את המוח בצלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ יבשה. באמצעות מרית מיקרו, להסיר את נורת הריח ואת המוח הקטן.
מעבירים את קליפת המוח לצלחת פטרי אחרת המכילה שני מיליליטר של HBSS ועוד 10%FBS. חותכים את רקמת המוח לחתיכות קטנות עם מספריים סטריליים ושימוש micropipette P1000, להעביר כל רקמת המוח עם HBSS בתוספת 10% FBS לצינורות חרוט שונים 15 מיליליטר. במידת הצורך, השתמש ב- HBSS ועוד 10%FBS כדי למלא את אמצעי האחסון הסופי לשני מיליליטר.
לשטוף את רקמת המוח לחתוך עם שלושה מיליליטר של HBSS בתוספת 10% FBS עבור כל צינור. לאחר ההשמדה, הסר בזהירות את העל-טבעי. חזור על השטיפה עם HBSS ועוד 10%FBS שלוש פעמים נוספות.
ואז לשטוף עם שלושה מיליליטר של HBSS טהור שלוש פעמים. לאחר ההשמדה, הסר בזהירות את העל-טבעי. לאחר מכן, מוסיפים שלושה מיליליטר של טריפסין ומ מניחים את הצינור באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בעדינות לנער את הצינורות כל חמש דקות.
זה מעכל את הרקמה שנאספה. הימנע בועות. כדי להשבית את טריפסין, לשטוף את הרקמה עם שלושה מיליליטר של HBSS בתוספת 10% FBS ולאחר decantation של הרקמה, להסיר בזהירות את supernatant.
חזור על שטיפה זו שלוש פעמים. לאחר מכן לשטוף את הרקמה עם שלושה מיליליטר של HBSS טהור ולחזור פעמיים נוספות. לאחר ניתוח הרקמה, הסר בזהירות את העל-טבעי.
הוסף שבעה מיליליטר של HBSS טהור הומוגניזציה של הרקמה דרך מעברים רצופים פיפטים, תחילה עם פיפטה סרולוגית 10 מיליליטר, ואחריו פיפט חמישה מיליליטר, ולבסוף עם micropipette P1000. לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה הצינורות ב 450 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור עם ארבעה מיליליטר של HBSS ועוד 10%FBS לכל צינור.
מעבירים את התאים לבקבוק T75 שטופל מראש באופן מסחרי להייתוך מיטבי של תאים. מניחים את הבקבוק באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך 30 דקות עבור דבקות. לאחר מכן הוסיפו 10 מיליליטר של DMEM F12 בתוספת לבקבוק והדגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני במשך שני לילות.
ביום השלישי, להסיר שבעה מיליליטר של מדיום תרבות מן הבקבוק T75 ולהוסיף שבעה מיליליטר של DMEM F12 טרי בתוספת. תחזיר את הבקבוקון לאנקובטור. ביום החמישי, כדי להסיר פסולת ותאים לא עקביים, החלף את כל המדיום מבקבוק T75 עם 14 מיליליטר של DMEM F12 טרי בתוספת.
ואז כל 48 שעות, להסיר שישה מיליליטר של supernatant ולהוסיף שבעה מיליליטר של טרי בתוספת DMEM F12 בינוני עד היום 14 של תרבות. ביום 14, לאחר הסרת שישה מיליליטר של על טבעי והוספת שבעה מיליליטר של טרי בתוספת DMEM F12 בינוני, לסגור את בקבוקי T75 בחוזקה עם עטיפת פלסטיק. מניחים אותם בשייקר מסלולית הרצפה ב 200 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס לילה כדי לנטרל מכנית microglia מאסטרוציטים.
ביום ה -15, לקחת את flasks מן השייקר במרץ לשטוף אותם עם המדיום שלהם על מנת לייעל את דיסוציאציה התא לקצור את המספר המרבי של microglia. ואז לאסוף את supernatant ולהעביר אותו לצינור חרוט 50 מיליליטר. לאחר מכן, מוסיפים ארבעה מיליליטר של טריפסין לכל בקבוק ודגירה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס על מנת לנתק את האסטרוציטים.
לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של DMEM F12 בתוספת כדי להשבית את טריפסין. לשטוף את flasks עם המדיום שלהם ולהעביר את התוכן צינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה כל הצינורות המכילים microglia דיסוציאציה או אסטרוציטים ב 450 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השלך את העל-טבעי. תן שימוש חוזר את גלולת microglia במיליליטר אחד של DMEM F12 בתוספת ואת האסטרוציטים ב 10 מיליליטר של DMEM F12 בתוספת. המשך לספירת תאים בתא Neubauer או מונה תאים אוטומטי.
צלחת התאים עם DMEM F12 בתוספת בצפיפות הרצויה בצלחת תרבות תא שטוחה מראש. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות כדי לאפשר להם לצרף. ביום ה-14, תרבות תאי הגלישה עברה דיסוציאציה מכנית.
הוא נצפה עם טוהר של 89.5% עבור אוכלוסיית האסטרוציטים ו-96.6% עבור אוכלוסיית המיקרוגליה. אסטרוציטים ו microglia מעכברי C57BL6 נדבקו T.cruzi Y.לאחר שעתיים, 48 שעות, ו 96 שעות, התאים תוקנו עם מתנול מוכתם עם סמן גרעין התא DAPI ואנטי GFAP. השימוש בטפילים מהונדסים גנטית המבטאת כתבים פלואורסצנטיים או טפילים המסומנים בנוגדנים פלואורסצנטיים ספציפיים שיפר את המיקרוסקופיה immunofluorescence מכיוון שהם נבדלים טוב יותר מגרעין התא.
שתי דוגמאות מוצגות כאן. זן T.gondii RH מבטא באופן מכונן זן YFP ו- T.cruzi Y מוכתם בנוגדן חד שבטי לא מסחרי 2C2 נגד SSP4 חלבון. חשוב לשטוף בזהירות את התאים כדי לא לאבד צבירות תאים.
לאחר זיהום בתאי גליה, ניתן להעריך פרמטרים אחרים כגון ELISA לייצור ציטוקין נוכח על טבעי, כתמים מערביים עבור ביטוי חלבון, ו PCR כמותי בזמן אמת להערכת שעתוק RNA. שאלות רבות הקשורות לתפקוד של תאי גלייה, למשל חילוף החומרים שלהם, התגובה החיסונית, וביולוגיה של התא עצמו ניתן לטפל ולהרוויח על ידי טכניקה זו. כל טפילי פרוטוזואה מסוגלים להדביק תאים אנושיים, כמו גם תאי עכבר תרבות ולכן חשוב להיות זהיר בעת טיפול טפיל זה.
