このプロトコルは、出生後マウスから最も豊富な2つのグリア細胞集団、アストロサイトおよびミクログリアを並行して抽出することに焦点を当てた方法を記述する。我々の方法は、同じ条件で同じ抽出中の両方の細胞型を取得および単離することに焦点を当てているため、アストロサイトおよびミクログリア分離のための他の記述されたプロトコルとは異なり、実験動物の使用を最適化し、免疫学的文脈におけるこれらの細胞の相対的役割の研究を改善する。このプロトコルは、例えば原虫寄生虫やウイルスなど、アルツハイマー、パーキンソン、感染症などの中枢神経系における多くの文脈および疾患におけるミクログリアおよびアストロサイトの役割をよりよく調査するのに有用である。
同じ抽出から両方の細胞型を取得および単離することは、感染または炎症などの免疫学的文脈の各細胞サブセットの比較役割を評価することが望ましい。人々は特に脳の除去と神経組織の洗い流しの間に注意する必要がありますが、私はこのプロトコルとビデオショットで、人々が苦労しないと信じています。このプロトコルは、皮質を抽出する動物の数に応じて長くすることができるので、約4時間以上を費やす準備をしてください。
初日には、純粋なHBSSとHBSSに加えて10%熱不活性化FBSを準備します。補足されたDMEM F12を準備し、0.22ミクロンのフィルターでそれをフィルターします。オートクレーブ内のすべての手術器具を殺菌し、処置の間に70%エタノールを使用する。
イオブルランを浸した綿を含む密閉されたチャンバーに新生児マウスを5分間入れて深遠な麻酔をする。70%エタノールでマウスの子犬をスプレーし、はさみで動物を切断します。頭蓋骨に沿ってハサミで矢状カットを行い、それを開き、脳を露出させます。
脳の完全性を維持するためにマイクロヘラを使用して脳を削除します。.乾燥した直径6センチメートルのペトリ皿に脳を置きます。マイクロスパチュラを使用して、嗅球と小脳を取り除きます。
HBSSの2ミリリットルプラス10%FBSを含む別のペトリ皿に皮質を移動します。滅菌はさみで小片に脳組織をカットし、P1000マイクロピペットを使用して、HBSSプラス10%FBSで各脳組織を異なる15ミリリットル円錐形チューブに移します。必要に応じて、HBSS +10%FBSを使用して、最終ボリュームを2ミリリットルに満たします。
切断された脳組織を、HBSSの3ミリリットルと各チューブに対して10%FBSで洗浄します。デカンテーション後、上清を慎重に取り除きます。HBSSと10%FBSでさらに3回洗浄を繰り返します。
その後、3ミリリットルの純粋なHBSSで3回洗います。デカンテーション後、上清を慎重に取り除きます。次に、3ミリリットルのトリプシンを加え、5分ごとにチューブを静かに振って30分間摂氏37度の水浴にチューブを入れます。
これは、収集された組織を消化します.泡を避けてください。トリプシンを不活性化するには、HBSSプラス10%FBSの3ミリリットルで組織を洗浄し、組織のデカンテーション後に、上清を慎重に除去する。
この洗浄を3回繰り返します。その後、純粋なHBSSの3ミリリットルで組織を洗浄し、さらに2回繰り返します。組織を脱栓した後、上清を慎重に除去する。
純粋なHBSSの7ミリリットルを追加し、ピペットの連続した通路を通して組織を均質化し、最初に10ミリリットルの血清ピペット、5ミリリットルのピペット、最後にP1000マイクロピペットで組織を均質化します。均質化後、チューブを摂氏4度で5分間450倍gで遠心分離する。上清を捨て、各チューブに4ミリリットルのHBSSと10%FBSでペレットを再懸濁します。
細胞を市販の前処理されたT75フラスコに移し、最適な細胞培養接着を行う。フラスコを37°Cのインキュベーターに37°Cで5%の二酸化炭素で30分間置き、付着します。その後、フラスコに10ミリリットルのDMEM F12を加え、摂氏37度、2泊で5%の二酸化炭素をインキュベートします。
3日目に、T75フラスコから7ミリリットルの培養培地を取り出し、新鮮な補充DMEM F12を7ミリリットル加えます。フラスコをインキュベーターに戻します。5日目に、破片および非接着性細胞を除去するために、T75フラスコからすべての培地を14ミリリットルの新鮮な補充DMEM F12と交換する。
その後、48時間ごとに、上清の6ミリリットルを除去し、培養の14日目まで新鮮な補充DMEM F12培地の7ミリリットルを追加します。14日目、6ミリリットルの上清を除去し、新鮮な補充されたDMEM F12培地を7ミリリットル加えた後、プラスチック包装でT75フラスコをしっかりと閉じます。200 RPMと摂氏37度の床軌道シェーカーに一晩置き、アストロサイトからミクログリアを機械的に解離します。
15日目には、シェーカーからフラスコを取り出し、細胞解離を最適化し、ミクログリアの最大数を収穫するために、独自の媒体でフラスコを精力的に洗浄します。その後、上清を収集し、50ミリリットルの円錐管に移します。次に、各フラスコにトリプシンを4ミリリットル加え、アストロサイトを取り外すために摂氏37度で5分間インキュベートします。
その後、トリプシンを不活性化するためにサプリメントDMEM F12の5ミリリットルを追加します。フラスコを独自の媒体で洗い、内容物を50ミリリットルの円錐形チューブに移します。遠心分離機 450回gで解約ミクログリアまたはアストロサイトを含む全てのチューブを摂氏4度で5分間行う。
上清を捨てます。1 ミリリットルのサプリメント DMEM F12 のマイクログリアペレットと、10 ミリリットルの DMEM F12 のアストロサイトを再中断します。ノイバウアーチャンバーまたは自動セルカウンターでセルカウントに進みます。
前処理された平底細胞培養プレートで所望の密度で、補充されたDMEM F12で細胞をプレートします。細胞を摂氏37度、炭酸ガス5%を24時間インキュベートして、24時間加熱します。14日目、グリア細胞培養は機械的解離を受けた。
これは、アストロサイト集団の純度89.5%、ミクログリア集団の96.6%の純度で観察された。C57BL6マウスからアストロサイトおよびミクログリアをT.cruzi Y.に感染させた後、2時間、48時間、および96時間後、チャンバーをメタノールで固定し、細胞ヌクレアーゼマーカーDAPIおよび抗GFAPで染色した。特定の蛍光抗体で標識された蛍光レポーターまたは寄生虫を発現する遺伝子組換え寄生虫の使用は、細胞核との区別が良いため、免疫蛍光顕微鏡を改善した。
ここでは、2 つの例を示します。非商業的モノクローナル抗体2C2抗SSP4タンパク質で染色されたYFPおよびT.cruzi Y株を構成的に発現するT.gondii RH株。細胞凝集体を失わないように、細胞を注意深く洗うことが重要です。
グリア細胞感染後、上清に存在するサイトカイン産生に関するELISA、タンパク質発現用のウェスタンブロッティング、RNA転写評価のためのリアルタイム定量PCRなどの他のパラメータを評価することができる。グリア細胞の機能に関連する多くの質問、例えば、その代謝、免疫応答、細胞生物学自体は、この技術によって対処され、恩恵を受けることができます。すべての原虫寄生虫は、ヒト細胞だけでなく、培養マウス細胞に感染することができるので、この寄生虫を扱うときに注意することが重要です。
