此方法可以帮助回答有关如何筛选植物病原体分泌的RNA沉默抑制剂的关键问题。该技术的主要优点是提供快速、准确和广泛的筛选检测，用于RNA沉默抑制器的识别。准备盆栽土壤混合物，包括50%的泥炭苔，30%的石，20%的紫土和120摄氏度的自动杀菌20分钟。
将自洗土壤与植物肥料溶液混合，以每升一克的速度混合，然后将它们分包装成储存在较大托盘中的较小锅中。将尼科蒂亚娜·贝塔米亚娜16c的一两个种子播种到每个锅的土壤表面。用塑料圆顶盖住托盘，让种子发芽。
将托盘放在光和温度控制的生长室下，温度为 23 至 25 摄氏度，相对湿度为 50 至 60%，且全天为长。三到四天后，种子发芽。关闭塑料圆顶，让幼苗在用于发芽步骤的相同条件下生长。
每两到三天，加入适当的水分，保持土壤湿润，但不浸泡。每10天，添加肥料，以促进进一步生长。保持尼科蒂亚娜贝thamiana 16c植物在正常条件下，直到植物有至少五个完全发达的真叶，没有可见的轴或花蕾，叶子有一个健康的绿色外观。
使用 10 至 14 天大的尼科蒂亚娜贝thamiana 16c 植物进行全身RNA沉默测定，使用3至4周大的尼科蒂亚娜贝thamiana 16c叶进行局部RNA沉默测定。使用尖端从LB板中挑选一个阳性菌落，将细胞接种到含有5毫升LB介质的玻璃管中，并辅以每毫升卡纳霉素50微克和每毫升利法霉素50微克。在 30 摄氏度下生长细胞，在 200 RPM 下摇晃 24 至 48 小时。
将培养的100微升转移到5毫升的LB介质中，并辅以相同的抗生素、10毫摩尔 MES，在pH 5.6，和20微摩尔A。在 30 摄氏度下生长细菌，在 200 RPM 下摇晃 16 至 20 小时。将细胞以4000倍g离心10分钟。丢弃上流液，将颗粒重新在两毫升10毫摩尔氯化镁缓冲液中。
重复洗涤，以确保完全去除抗生素。通过测量 600 纳米的光学密度，确定农业细菌培养的密度。使用 10 毫摩尔氯化镁缓冲液调整细胞培养，使 1.5 至 2.0 的 OD 600。
在pH 5.6和150微摩尔S下加入10毫摩尔 MES，加入最终悬浮培养，并在室温下孵育细胞至少3小时，不摇晃。混合含有35S绿色荧光蛋白的农业细菌培养物与含有35S黄瓜马赛克病毒抑制剂2b、作用器或空载体的农业细菌培养物的等量。使用一毫升无针注射器，小心和缓慢地渗透到尼科蒂亚娜贝thamiana 16c叶的亚基亚叶的亚基亚侧的混合农业细菌悬浮液。
用软组织湿巾从叶子上去除剩余的细菌悬浮液，然后用记号笔圈出渗透斑块的边缘。渗透后三到四天，使用长波紫外灯直观地检测出渗透的树叶片中的GGFP荧光。渗透后两周，使用灯检测整个植物新生长的叶子，进行系统RNA沉默。
为了在渗透后四到七天内从叶组织中分离出总RNA，请从渗入的尼科蒂亚娜贝thamiana 16c斑块中收集叶组织，将其收集到迫击炮中。将液氮放入砂浆中，用研磨棒将组织研磨成细粉末，然后将粉末转移到无菌的两毫升管中。立即将每 100 毫克组织一毫升的 RNA 分离试剂添加到机罩中的样品管中，用力将涡流加入均质，并在室温下孵育五分钟。
每毫升RNA分离试剂的体积为200微升加入氯仿，加入到机罩中每个管中，大力摇动15秒，并在室温下孵育5分钟。在4摄氏度下以12，000倍g离心15分钟。将上一液转移到新的无 RNase 管中，然后丢弃颗粒。
在上流液中加入0.7体积异丙醇，轻轻反转数次，并在室温下孵育混合物10分钟。在4摄氏度下，以12，000次g的离心将RNA颗粒沉淀15分钟。丢弃上一杯。
用 70%乙醇清洗颗粒，将颗粒在罩中风干。在65摄氏度的水浴中孵育10至20分钟，将RNA溶解在二乙基热碳酸盐处理水中。要对GP信使RNA水平进行北方印迹分析，在1X MOPS运行缓冲液中准备1.2%甲醛变性甲糖凝胶。
将RNA一对一地与RNA加载染料混合，在65摄氏度下孵育RNA10分钟。立即将变性样品冷却在冰上一分钟。使用移液器，将样品以 100 伏电压将样品加载到凝胶和电泳的孔中 50 分钟，直到 RNA 分离良好。
将凝胶冲洗成20X盐水柠檬酸钠缓冲液，去除甲醛。通过设置20X盐水柠檬酸钠缓冲液、一层纸巾、两层湿什么纸、一层凝胶、一层尼龙膜、两层湿 Whatman 纸、两层干 Whatman 纸、一块玻璃板和一个重量，在一夜之间执行毛细管转移。早晨，凝胶中的RNA被转移到尼龙膜上。
将膜浸泡在2X盐水柠檬酸钠中，通过将湿膜暴露在UV交联中，将RNA固定到膜上。按照手稿进行。三到四周大的尼科蒂亚娜贝thamiana 16c植物的完全发育的叶子与携带 35S GFP 的农业细菌混合物共同渗透在补丁中。
渗透后四天，渗透区域的GP荧光在自然光和长波紫外光下被成像。北方印迹显示，GFP信使RNA在表达35S GFP加35S CMV2b或35S GFP加35S PSR1的叶子中积累高于表达35S GFP加EV的叶子。进行了农业渗透测定，以评估沉默信号在两周大的尼科蒂亚娜贝thamiana16c幼苗的叶子上的传播。在渗透后14天，超过98%的EV在系统叶子中没有明显的GP信号。
而CMV2b和PSR1都有效地抑制了沉默信号的系统性扩散。在约80%的共渗透植物中观察到GP荧光，在其余20%的渗透植物中，只有几条红静脉出现在新出现的叶子中。这项技术为研究人员识别许多植物病原体分泌的新的RNA沉默抑制剂铺平了道路。
植物和适当的OD的组合是尝试此过程时要记住的最重要的事情。按照此程序，可以进行RNA沉默抑制器的功能表征，以探索这些抑制器如何压按宿主RNA沉默的机制以及输出是什么。当您渗入工厂时，请戴上安全护目镜，并在所有实验步骤中戴上乳胶手套。
