Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como rastrear os supressores de silenciamento de RNA secretados por patógenos vegetais. A principal vantagem desta técnica é fornecer um ensaio de triagem rápido, preciso e extensivo para identificação de supressores de silenciamento de RNA. Prepare misturas de solo de vasos compostas por 50% de musgo de turfa, 30% perlite e 20% vermiculite e autoclave a 120 graus Celsius por 20 minutos.
Mergulhe as misturas de solo autoclaved com solução de fertilizante vegetal a um grama por litro e subembale-as em potes menores armazenados em uma bandeja maior. Semear uma ou duas sementes de Nicotiana bethamiana 16c na superfície do solo de cada vaso. Cubra a bandeja com uma cúpula de plástico e deixe as sementes germinarem.
Coloque a bandeja sob câmaras de crescimento controladas pela luz e temperatura com uma temperatura de 23 a 25 graus Celsius, 50 a 60% de umidade relativa e um longo período de tempo. Depois de três a quatro dias, as sementes germinam. Tire a cúpula de plástico e permita que as mudas cresçam sob as mesmas condições utilizadas para a etapa de germinação.
A cada dois ou três dias, adicione uma quantidade apropriada de água mantendo o solo úmido, mas não encharcado. A cada 10 dias, adicione fertilizante para promover um crescimento maior. Mantenha as plantas nicotiana bethamiana 16c em condições normais até que as plantas tenham pelo menos cinco folhas verdadeiras totalmente desenvolvidas sem botões axilares ou florais visíveis e as folhas têm uma aparência verde saudável.
Use plantas nicotiana bethamiana de 10 a 14 dias para ensaios de silenciamento de RNA sistêmico e folhas de três a quatro semanas de nicotiana bethamiana 16c para ensaios locais de silenciamento de RNA. Use uma dica para escolher uma colônia positiva da placa LB e inocular as células em um tubo de vidro contendo cinco mililitros de meio LB suplementados com 50 microgramas por mililitro Kanamycin e 50 microgramas por mililitro Rifampicin. Cresça as células a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM por 24 a 48 horas.
Transfira 100 microliters da cultura em cinco mililitros de meio LB suplementados com os mesmos antibióticos, 10 mililitros MES no pH 5.6 e 20 micromolar AS. Cresça a bactéria a 30 graus Celsius com tremor a 200 RPM por 16 a 20 horas. Centrifugar as células a 4.000 vezes g por 10 minutos. Descarte o supernascer e resuspenque a pelota em dois mililitros de 10 mililitros de cloroium tampão de cloreto de magnésio.
Repita a lavagem para garantir a remoção completa dos antibióticos. Determine a densidade da cultura Agrobacterium medindo a densidade óptica em 600 nanômetros. Ajuste a cultura celular com 10 mililitros de cloreto de magnésio a um OD 600 de 1,5 a 2,0.
Adicione 10 milimôlares MES no pH 5.6 e 150 micromolar AS à cultura final de suspensão e incubar as células em temperatura ambiente por pelo menos três horas sem tremer. Misture volumes iguais de uma cultura agrobacterium contendo proteína fluorescente verde 35S com uma cultura agrobacterium contendo supressor de vírus do mosaico de pepino 35S 2b, efeito putativo ou vetor vazio. Usando uma seringa sem agulha de um mililitro, infiltrar-se cuidadosamente e lentamente nas suspensões mistas de Agrobacterium nas laterais abaxial das folhas de Nicotiana bethamiana 16c.
Remova a suspensão bacteriana restante das folhas com lenços de tecido mole e circule as margens das manchas infiltradas com uma caneta marcadora. Três a quatro dias após a infiltração, use uma lâmpada ultravioleta de ondas longas para detectar visualmente a fluorescência GFP nas manchas infiltradas das folhas. Duas semanas após a infiltração, use a lâmpada para detectar folhas recém-cultivadas de toda a planta para silenciar RNA sistêmico.
Para isolar o RNA total do tecido da folha em quatro a sete dias após a infiltração, colete os tecidos da folha das manchas de Nicotiana bethamiana 16c infiltradas em uma argamassa. Coloque nitrogênio líquido na argamassa e triture o tecido em um pó fino com uma vara de moagem e transfira o pó para um tubo estéril de dois mililitros. Adicione imediatamente o reagente de isolamento de RNA ao volume de um mililitro por 100 miligramas de tecido ao tubo de amostra em um capô, vórtice vigorosamente para homogeneizar e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.
Adicione clorofórmio ao volume de 200 microliters por um mililitro de reagente de isolamento de RNA a cada tubo no capô, agite vigorosamente por 15 segundos e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Centrifugar o homogeneizar a 12.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernatante para um novo tubo sem RNase e descarte a pelota.
Adicione 0,7 volume de isopropanol ao supernasciente, inverta suavemente várias vezes e incubar a mistura à temperatura ambiente por 10 minutos. Precipitar a pelota de RNA por centrifugação a 12.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernaspeso.
Lave a pelota com 70% de etanol e seque a pelota em um capô. Dissolva o RNA em água tratada com pirocarbonato de dietil incubando em um banho de água de 65 graus Celsius por 10 a 20 minutos. Para realizar a análise de manchas do Norte dos níveis de RNA do mensageiro GFP, prepare um gel de agarose de desnatação de formaldeído de 1,2% em 1X MOPS em execução de buffer.
Misture o RNA um-a-um com corante de carregamento de RNA e desnaturar o RNA por incubação a 65 graus Celsius por 10 minutos. Esfrie imediatamente as amostras desnaturadas no gelo por um minuto. Com uma pipeta, carregue as amostras nos poços do gel e eletroforese a 100 volts por 50 minutos até que o RNA esteja bem separado.
Enxágüe o gel em 20X tampão de citrato de sódio salino para remover o formaldeído. Realize a transferência capilar durante a noite, configurando 20X tampão de citrato de sódio salino, uma camada de papel toalha, duas camadas de papel Whatman molhado, uma camada de gel, uma camada de membrana de nylon, duas camadas de papel Whatman molhado, duas camadas de papel Whatman seco, uma placa de vidro e um peso. Pela manhã, o RNA no gel é transferido para a membrana de nylon.
Mergulhe a membrana em 2X citrato de sódio salino e fixe o RNA na membrana expondo a membrana úmida ao crosslinking UV. Prossiga de acordo com o manuscrito. Folhas totalmente desenvolvidas de três a quatro semanas de plantas Nicotiana bethamiana 16c foram co-infiltradas em remendos com misturas de Agrobacterium que transportavam 35S GFP.
Aos quatro dias após a infiltração, a fluorescência GFP da área infiltrada foi imagen sob luz natural e luz UV de ondas longas. A mancha norte revelou que o RNA do mensageiro GFP acumulou maior nas folhas expressando 35S GFP mais 35S CMV2b ou 35S GFP mais 35S PSR1 do que nas folhas expressando 35S GFP mais EV. O ensaio de agroinfiltração foi realizado para avaliar a disseminação do sinal de silenciamento nas folhas das mudas Nicotiana bethamiana 16c de duas semanas. Em 14 dias após a infiltração, mais de 98% do EV não apresentava sinalização óbvia de GFP em folhas sistêmicas.
Considerando que tanto o CMV2b quanto o PSR1 inibiram eficientemente a propagação sistêmica do sinal de silenciamento. A fluorescência GFP foi observada em cerca de 80% das plantas co-infiltradas e nos 20% restantes das plantas infiltradas com apenas algumas veias vermelhas apareceram em folhas recém-emergidas. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores identificarem novos supressores de silenciamento de RNA secretados por muitos patógenos vegetais.
A combinação de plantas e o OD adequado é a coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento. Após este procedimento, a caracterização funcional do supressor de silenciamento de RNA pode ser feita para explorar o mecanismo de como esses supressores pressionam o silenciamento do RNA do host e qual é a saída. Por favor, use os óculos de segurança quando você se infiltrar nas plantas e também use as luvas de látex durante todas as etapas do experimento.
