Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo examinar los supresores de silenciamiento de ARN secretados por patógenos vegetales. La principal ventaja de esta técnica es proporcionar un ensayo de cribado rápido, preciso y extenso para la identificación de supresores de silenciamiento de ARN. Preparar mezclas de tierra para macetas que consisten en 50%musgo de turba, 30% de perlita, y 20%vermiculita y autoclave a 120 grados Celsius durante 20 minutos.
Remoje las mezclas de suelo autoclaves con la solución de fertilizante vegetal a un gramo por litro y las supaque en macetas más pequeñas almacenadas en una bandeja más grande. Siembre una o dos semillas de Nicotiana bethamiana 16c sobre la superficie del suelo de cada maceta. Cubra la bandeja con una cúpula de plástico y deje que las semillas germinen.
Coloque la bandeja bajo cámaras de crecimiento ligeras y controladas por temperatura con una temperatura de 23 a 25 grados centígrados, 50 a 60% de humedad relativa y un fotoperiodo de largo día. Después de tres o cuatro días, las semillas germinan. Quite la cúpula de plástico y deje que las plántulas crezcan en las mismas condiciones utilizadas para el paso de germinación.
Cada dos o tres días, añadir una cantidad adecuada de agua manteniendo el suelo húmedo pero no empapado. Cada 10 días, añadir fertilizante para promover un mayor crecimiento. Mantener las plantas de Nicotiana bethamiana 16c en condiciones normales hasta que las plantas tengan al menos cinco hojas verdaderas completamente desarrolladas sin cogollos axilares o florales visibles y las hojas tengan un aspecto verde saludable.
Utilice plantas Nicotiana bethamiana 16c de 10 a 14 días de edad para ensayos de silenciamiento de ARN sistémico y hojas de tres a cuatro semanas de edad de Nicotiana bethamiana 16c para ensayos de silenciamiento de ARN local. Utilice una punta para recoger una colonia positiva de la placa LB e inocular las células en un tubo de vidrio que contenga cinco mililitros de medio LB complementado con 50 microgramos por mililitro Kanamicina y 50 microgramos por mililitro Rifampicina. Crecer las células a 30 grados Celsius con temblor a 200 RPM durante 24 a 48 horas.
Transfiera 100 microlitros del cultivo a cinco mililitros de medio LB complementados con los mismos antibióticos, 10 MES mililolares a pH 5.6 y 20 micromolarES AS. Cultivar las bacterias a 30 grados celsius con temblores a 200 RPM durante 16 a 20 horas. Centrifugar las células a 4.000 g durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet en dos mililitros de 10 tampones de cloruro de magnesio milimolar.
Repita el lavado para garantizar la eliminación completa de los antibióticos. Determinar la densidad del cultivo de Agrobacterium midiendo la densidad óptica a 600 nanómetros. Ajuste el cultivo celular con 10 tampón de cloruro de magnesio mililolar a un OD 600 de 1,5 a 2,0.
Añadir 10 MES mililolares a pH 5,6 y 150 micromolarES AS al cultivo de suspensión final e incubar las células a temperatura ambiente durante al menos tres horas sin agitar. Mezclar volúmenes iguales de un cultivo de Agrobacterium que contenga proteína fluorescente verde 35S con un cultivo de Agrobacterium que contenga un supresor de virus de mosaico de pepino 35S 2b, efector putativo o vector vacío. Usando una jeringa sin aguja de un mililitro, infíltrate cuidadosamente y lentamente en las suspensiones mixtas de Agrobacterium en los lados abaxiales de las hojas de Nicotiana bethamiana 16c.
Retire la suspensión bacteriana restante de las hojas con toallitas de tejido blando y circule los márgenes de los parches infiltrados con un rotulador. De tres a cuatro días después de la infiltración, utilice una lámpara ultravioleta de onda larga para detectar visualmente la fluorescencia de la GFP en los parches infiltrados de las hojas. Dos semanas después de la infiltración, utilizar la lámpara para detectar hojas recién cultivadas de toda la planta para el silenciamiento sistémico de ARN.
Para aislar el ARN total del tejido de la hoja a los cuatro a siete días después de la infiltración, recoja los tejidos de las hojas de los parches de Nicotiana bethamiana 16c infiltrados en un mortero. Coloque nitrógeno líquido en el mortero y muele el tejido en un polvo fino con una varilla de molienda y transfiera el polvo a un tubo estéril de dos mililitros. Añadir inmediatamente el reactivo de aislamiento de ARN al volumen de un mililitro por cada 100 miligramos de tejido al tubo de muestra en una campana, vórtice vigorosamente para homogeneizar, e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Añadir cloroformo al volumen de 200 microlitros por mililitro de reactivo de aislamiento de ARN a cada tubo de la campana, agitar vigorosamente durante 15 segundos e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrifugar el homogeneizar a 12.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo libre de RNase y deseche el pellet.
Añadir 0,7 volumen de isopropanol al sobrenadante, invertir suavemente varias veces e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Precipitar el pellet de ARN por centrifugación a 12.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante.
Lavar el pellet con 70% etanol y secar al aire el pellet en una capucha. Disolver el ARN en agua tratada con pirocarbonato dietil incubando en un baño de agua de 65 grados Celsius durante 10 a 20 minutos. Para realizar el análisis de la mancha del norte de los niveles de ARN mensajero GFP, prepare un gel de agarosa desnaturalización de formaldehído del 1,2%en búfer de funcionamiento 1X MOPS.
Mezcle el ARN uno a uno con el tinte de carga de ARN y desnaturalizar el ARN por incubación a 65 grados centígrados durante 10 minutos. Enfríe inmediatamente las muestras desnaturaladas sobre hielo durante un minuto. Con una pipeta, cargue las muestras en los pozos del gel y electroforos a 100 voltios durante 50 minutos hasta que el ARN esté bien separado.
Enjuague el gel en un tampón de citrato sódico 20X para eliminar el formaldehído. Realice la transferencia capilar durante la noche mediante la configuración de un tampón de citrato de sodio salino 20X, una capa de toalla de papel, dos capas de papel Whatman húmedo, una capa de gel, una capa de membrana de nylon, dos capas de papel Whatman húmedo, dos capas de papel Whatman seco, una placa de vidrio y un peso. Por la mañana, el ARN del gel se transfiere a la membrana de nylon.
Remoje la membrana en citrato de sodio salino 2X y fije el ARN a la membrana exponiendo la membrana húmeda a la reticulación UV. Proceda según el manuscrito. Hojas completamente desarrolladas de tres a cuatro semanas de edad, nicotiana bethamiana 16c, fueron coin infiltradas en parches con mezclas de Agrobacterium que transportaban GFP 35S.
A los cuatro días posteriores a la infiltración, la fluorescencia GFP de la zona infiltrada fue imán bajo luz natural y luz UV de onda larga. Northern blot reveló que el ARN mensajero GFP se acumuló más alto en las hojas que expresan 35S GFP más 35S CMV2b o 35S GFP más 35S PSR1 que en las hojas que expresan 35S GFP más EV. Se realizó un ensayo de agroinfiltración para evaluar la propagación de la señal de silenciamiento en las hojas de las plántulas Nicotiana bethamiana 16c de dos semanas de edad. A los 14 días posteriores a la infiltración, más del 98% del EV no exhibió señalización obvia de la GFP en las hojas sistémicas.
Mientras que tanto CMV2b como PSR1 inhibió eficientemente la propagación sistémica de la señal de silenciamiento. La fluorescencia de la GFP se observó en aproximadamente el 80% de las plantas coin infiltradas y en el 20% restante de plantas infiltradas con sólo unas pocas venas rojas aparecieron en hojas recién emergidas. Esta técnica allana el camino para que los investigadores identifiquen nuevos supresores de silenciamiento de ARN secretados por muchos patógenos vegetales.
La combinación de plantas y la OD adecuada es lo más importante a recordar al intentar este procedimiento. Después de este procedimiento, la caracterización funcional del supresor de silenciamiento de ARN se puede hacer para explorar el mecanismo de cómo estos supresores presionan el silenciamiento del ARN host y cuál es la salida. Por favor, use las gafas de seguridad cuando se infiltre en las plantas y también use los guantes de látex durante todos los pasos del experimento.
