Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, wie man die RNA-Silencing-Suppressoren, die von Pflanzenpathogenen sezerniert werden, abschirmt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, einen schnellen, genauen und umfangreichen Screening-Test zur Identifizierung von RNA-Silencing-Suppressoren bereitzustellen. Bereiten Sie Topfbodenmischungen vor, die aus 50% Torfmoos, 30% Perlit und 20% Vermiculit und Autoklaven bei 120 Grad Celsius für 20 Minuten bestehen.
Die autoklavierten Bodenmischungen mit Pflanzendüngerlösung mit einem Gramm pro Liter einweichen und in kleinere Töpfe, die in einem größeren Tablett gelagert sind, unterpacken. Säen Sie ein oder zwei Samen von Nicotiana bethamiana 16c auf die Bodenoberfläche jedes Topfes. Bedecken Sie das Tablett mit einer Kunststoffkuppel und lassen Sie die Samen keimen.
Platzieren Sie das Tablett unter licht- und temperaturgeregelten Wachstumskammern mit einer Temperatur von 23 bis 25 Grad Celsius, 50 bis 60 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer langen Tag-Photoperiode. Nach drei bis vier Tagen keimen die Samen. Nehmen Sie die Kunststoffkuppel ab und lassen Sie die Sämlinge unter den gleichen Bedingungen wachsen, die für den Keimschritt verwendet werden.
Alle zwei bis drei Tage eine angemessene Menge Wasser hinzufügen, die den Boden feucht, aber nicht einweichen. Alle 10 Tage Dünger hinzufügen, um weiteres Wachstum zu fördern. Bewahren Sie Nicotiana bethamiana 16c Pflanzen unter normalen Bedingungen, bis die Pflanzen mindestens fünf voll entwickelte echte Blätter ohne sichtbare Achsel- oder Blütenknospen haben und die Blätter ein gesundes grünes Aussehen haben.
Verwenden Sie 10 bis 14 Tage alte Nicotiana bethamiana 16c Pflanzen für systemische RNA-Silencing-Assays und drei bis vier Wochen alte Blätter von Nicotiana bethamiana 16c für lokale RNA-Silencing-Assays. Verwenden Sie eine Spitze, um eine positive Kolonie aus der LB-Platte zu pflücken und die Zellen in ein Glasrohr mit fünf Millilitern LB-Medium zu impfen, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und 50 Mikrogramm pro Milliliter Rifampicin. Wachsen Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 RPM für 24 bis 48 Stunden.
Übertragen Sie 100 Mikroliter der Kultur in fünf Milliliter LB-Medium, ergänzt mit den gleichen Antibiotika, 10 Millimolar MES bei pH 5,6 und 20 Mikromolar AS. Wachsen Sie die Bakterien bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 RPM für 16 bis 20 Stunden. Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 4.000 mal g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in zwei Millilitern 10 Millimolar Magnesiumchloridpuffer wieder auf.
Wiederholen Sie die Wäsche, um die vollständige Entfernung von Antibiotika zu gewährleisten. Bestimmen Sie die Dichte der Agrobacterium-Kultur, indem Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern messen. Stellen Sie die Zellkultur mit 10 Millimolaren Magnesiumchloridpuffer auf eine OD 600 von 1,5 bis 2,0 ein.
Fügen Sie 10 Millimolar MES bei pH 5,6 und 150 Mikromolar AS in die endgültige Suspensionskultur ein und inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für mindestens drei Stunden ohne Schütteln. Mischen Sie gleiche Volumina einer Agrobacterium-Kultur, die 35S grünes fluoreszierendes Protein enthält, mit einer Agrobacterium-Kultur, die 35S Gurkenmosaikvirus-Suppressor 2b, vermeintlichen Effektor oder leeren Vektor enthält. Mit einer ein Milliliter nadellosen Spritze die gemischten Agrobacterium Suspensionen an den abaxialen Seiten der Nicotiana bethamiana 16c Blätter vorsichtig und langsam infiltrieren.
Entfernen Sie die verbleibende bakterielle Suspension von den Blättern mit Weichteiltüchern und kreisen Sie die Ränder der infiltrierten Pflaster mit einem Markerstift. Drei bis vier Tage nach der Infiltration, verwenden Sie eine langwellige ULTRAviolette Lampe, um die GFP-Fluoreszenz in den infiltrierten Blättern visuell zu erkennen. Zwei Wochen nach der Infiltration, verwenden Sie die Lampe, um neu gewachsene Blätter der gesamten Pflanze für systemische RNA-Silencing zu erkennen.
Um die gesamte RNA nach der Infiltration vier bis sieben Tage lang aus dem Blattgewebe zu isolieren, sammeln Sie das Blattgewebe aus den infiltrierten Nicotiana bethamiana 16c-Pflastern in einen Mörtel. Flüssigstickstoff in den Mörtel geben und das Gewebe mit einer Schleifstange in ein feines Pulver schleifen und in ein steriles Zwei-Milliliter-Rohr geben. Fügen Sie das RNA-Isolationsreagenz mit einem Volumen von einem Milliliter pro 100 Milligramm Gewebe sofort in das Probenröhrchen in einer Haube ein, wirbeln Sie kräftig, um zu homogenisieren, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
Chloroform mit einem Volumen von 200 Mikrolitern pro Milliliter RNA-Isolationsreagenz in jedes Rohr in der Haube geben, 15 Sekunden lang kräftig schütteln und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubieren. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 12.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand in ein neues RNase-freies Rohr und entsorgen Sie das Pellet.
0,7 Volumen Isopropanol in den Überstand geben, mehrmals sanft invertieren und die Mischung bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren. Niederschlagen Sie das RNA-Pellet durch Zentrifugation bei 12.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand.
Waschen Sie das Pellet mit 70% Ethanol und trocknen Sie das Pellet in einer Haube. Lösen Sie die RNA in mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser auf, indem Sie sie 10 bis 20 Minuten in einem 65 Grad Celsius Wasserbad inkubieren. Um die Northern Blot-Analyse der GFP-Boten-RNA-Spiegel durchzuführen, bereiten Sie ein 1,2%formaldehyd-denaturierendes Agarose-Gel in 1X MOPS Laufpuffer vor.
Mischen Sie die RNA eins zu eins mit RNA-Ladefarbstoff und denaturieren Sie die RNA durch Inkubation bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Die denaturierten Proben sofort eine Minute auf Eis abkühlen lassen. Mit einer Pipette die Proben 50 Minuten lang in die Brunnen des Gels und der Elektrophorese laden, bis die RNA gut getrennt ist.
Spülen Sie das Gel in 20X Saline-Natriumcitratpuffer, um das Formaldehyd zu entfernen. Führen Sie kapillare Übertragung über Nacht durch Die Einrichtung 20X Kochsamen-Natrium-Citrat-Puffer, eine Schicht Papiertuch, zwei Schichten nassen Whatman-Papier, eine Schicht Gel, eine Schicht Nylon-Membran, zwei Schichten nassen Whatman-Papier, zwei Schichten trockenes Whatman-Papier, eine Glasplatte und ein Gewicht. Am Morgen wird die RNA im Gel auf die Nylonmembran übertragen.
Die Membran in 2X-Saline-Natriumcitrat einweichen und die RNA an der Membran fixieren, indem Sie die nasse Membran UV-Vernetzung aussetzen. Gehen Sie nach dem Manuskript. Voll entwickelte Blätter von drei bis vier Wochen alten Nicotiana bethamiana 16c Pflanzen wurden in Pflastern mit Agrobacterium-Mischungen mit 35S GFP mitinfiltriert.
Vier Tage nach der Infiltration wurde die GFP-Fluoreszenz des infiltrierten Bereichs unter natürlichem Licht und langwelligem UV-Licht abgebildet. Northern Blot zeigte, dass GFP-Boten-RNA sich höher in den Blättern angesammelt emittierte, die 35S GFP plus 35S CMV2b oder 35S GFP plus 35S PSR1 ausdrückten, als in den Blättern, die 35S GFP plus EV exdrückten. Agroinfiltrationstest wurde durchgeführt, um die Ausbreitung des Schalldämpfersignals in den Blättern der zwei Wochen alten Nicotiana bethamiana 16c Sämlinge zu bewerten. Nach 14 Tagen nach der Infiltration zeigten mehr als 98% des EV keine offensichtliche GFP-Signalisierung in systemischen Blättern.
Während sowohl CMV2b als auch PSR1 die systemische Ausbreitung des Silencing-Signals effizient verhinderten. Die GFP-Fluoreszenz wurde bei etwa 80 % der mitinfiltrierten Pflanzen beobachtet und in den verbleibenden 20 % der infiltrierten Pflanzen mit nur wenigen roten Adern in neu entstehenden Blättern. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, neuartige RNA-Silencing-Suppressoren zu identifizieren, die von vielen Pflanzenpathogenen sezerniert werden.
Die Kombination von Pflanzen und der richtigen OD ist das Wichtigste, was man sich beim Versuch dieses Verfahrens merken sollte. Nach diesem Verfahren kann die funktionelle Charakterisierung des RNA-Silencing-Suppressors durchgeführt werden, um den Mechanismus zu untersuchen, wie diese Unterdrücker die Wirts-RNA-Silencing drücken und was der Output ist. Bitte tragen Sie die Schutzbrille, wenn Sie Pflanzen infiltrieren und tragen Sie auch die Latexhandschuhe während aller Experimentierschritte.
