Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как экран РНК заглушая супрессоры выделяется растительных патогенов. Основным преимуществом этого метода является обеспечение быстрого, точного и обширного анализа скрининга для идентификации супрессоров РНК. Подготовка заливки почвы смеси, состоящие из 50%торфяной мох, 30%perlite, и 20%вермикулит и автоклав при 120 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
Замочите автоклав почвы смешивается с раствором растительных удобрений на один грамм на литр и подупаковать их в меньшие горшки, хранящиеся в большей лоток. Посеять один или два семена Никотиана бетамиана 16c на поверхности почвы каждого горшка. Накройте лоток пластиковым куполом и дайте семенам прорасти.
Поместите лоток под светлые и контролируемые температурой камеры роста с температурой от 23 до 25 градусов по Цельсию, от 50 до 60% относительной влажности, и длинный день photoperiod. Через три-четыре дня семена прорастают. Смойте пластиковый купол и дайте саженцам расти в тех же условиях, что и для прорастания.
Каждые два-три дня, добавить соответствующее количество воды, сохраняя почву влажной, но не замачивания. Каждые 10 дней добавляйте удобрения, чтобы способствовать дальнейшему росту. Поддерживайте растения Nicotiana bethamiana 16c в нормальных условиях до тех пор, пока растения не будут иметь по крайней мере пять полностью развитых истинных листьев без видимых подмыслий или цветочных почек, а листья имеют здоровый зеленый вид.
Используйте от 10 до 14-дневного Nicotiana bethamiana 16c растений для системных РНК заглушая анализы и от трех до четырех недель листья Nicotiana bethamiana 16c для местных РНК заглушая анализы. Используйте наконечник, чтобы выбрать положительную колонию из пластины LB и привить клетки в стеклянную трубку, содержащую пять миллилитров среды LB, дополненную 50 микрограммами на миллилитр канамицин и 50 микрограммами на миллилитр рифампицин. Выращиваем клетки при 30 градусах Цельсия при тряске при 200 об/мин в течение 24-48 часов.
Перенесите 100 микролитров культуры в пять миллилитров ЛБ-среды, дополненных теми же антибиотиками, 10 миллимоляров МЕ при рН 5,6 и 20 микромоляров AS. Выращиваем бактерии при 30 градусах Цельсия при тряске при 200 об/мин в течение 16-20 часов. Центрифуга клетки на 4000 раз г в течение 10 минут. Отбросьте супернатант и повторно посовелите гранулы в два миллилитров 10 миллимолярный хлорид магния буфера.
Повторите стирку, чтобы обеспечить полное удаление антибиотиков. Определите плотность культуры агробактерий, измерив оптическую плотность на 600 нанометров. Отрегулируйте культуру клеток с буфером хлорида магния 10 миллимоля до OD 600 от 1,5 до 2,0.
Добавьте 10 миллимолярной МЕS при рН 5,6 и 150 микромолях AS к окончательной культуре подвески и инкубировать клетки при комнатной температуре в течение по крайней мере трех часов без встряхивания. Смешайте равные объемы культуры агробактерий, содержащей 35S зеленый флуоресцентный белок, с культурой агробактерий, содержащей супрессор вируса мозаики 35S 2b, мнимый эффектор или пустой вектор. Используя один миллилитр без иглы шприц, тщательно и медленно проникают смешанные подвески Agrobacterium на абаксиальных сторонах листьев Nicotiana bethamiana 16c.
Удалите оставшуюся бактериальную суспензию с листьев салфетками мягких тканей и обвямите края проникших патчей маркерной ручкой. Три-четыре дня после инфильтрации, использовать длинную волну ультрафиолетовой лампы для визуального обнаружения флуоресценции GFP в проникли участки листьев. Две недели после инфильтрации, использовать лампу для обнаружения вновь выращенных листьев всего растения для системного глушиния РНК.
Чтобы изолировать общую РНК от листьев ткани на четыре-семь дней после инфильтрации, собирать ткани листьев из проникли Никотиана бетамиана 16c патчи в раствор. Поместите жидкий азот в раствор и измельчите ткань в мелкий порошок с шлифовальным стержнем и перенесите порошок в стерильную двухми миллилитровую трубку. Немедленно добавьте реагент изоляции РНК при объеме одного миллилитра на 100 миллиграммов ткани в образец трубки в капюшоне, вихрь энергично гомогенат, и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.
Добавьте хлороформ при объеме 200 микролитров на один миллилитр реагента изоляции РНК в каждую трубку в капюшоне, энергично встряхните в течение 15 секунд и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Центрифуга гомогената при 12 000 раз г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую трубку без RNase и отбросьте гранулы.
Добавьте 0,7 тома изопропанола к супернатанту, аккуратно инвертировать несколько раз и инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 10 минут. Осадок РНК гранулы центрифугации на 12000 раз г в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию. Откажитесь от супернатанта.
Вымойте гранулы с 70% этанола и воздуха сухой гранулы в капюшоне. Растворите РНК в дитил пирокарбоната обработанной воды путем инкубации в 65 градусов по Цельсию водяной бане в течение 10 до 20 минут. Для выполнения северного анализа помарки уровней РНК-мессенджера GFP подготовьтесь к 1,2%формальдегиду, денатурации агарозного геля в 1X MOPS бегущем буфере.
Смешайте РНК один на один с РНК загрузки красителя и денатурации РНК путем инкубации при 65 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Немедленно охладите денатурированные образцы на льду в течение одной минуты. С пипеткой, загрузить образцы в скважины геля и электрофорезе на 100 вольт в течение 50 минут, пока РНК хорошо отделены.
Промыть гель в 20X солевой цитрат буфера натрия, чтобы удалить формальдегид. Выполните капиллярную передачу на ночь, установив 20X солевой цитрат буфер, один слой бумажного полотенца, два слоя мокрой бумаги Whatman, один слой геля, один слой нейлоновой мембраны, два слоя мокрой бумаги Whatman, два слоя сухой бумаги Whatman, одна стеклянная пластина, и вес. Утром РНК в гель переносится на нейлоновую мембрану.
Замочите мембрану в 2X солевой цитрат натрия и исправить РНК на мембрану, подвергая мокрой мембраны УФ перекрестного. Продолжить в соответствии с рукописью. Полностью развитые листья трех-четырехнедельных растений Nicotiana bethamiana 16c были совместно проникли в патчи со смесью Agrobacterium, несущей 35S GFP.
В течение четырех дней после инфильтрации, GFP флуоресценции проникли области был изображен под естественным светом и длинной волной УФ-излучения. Северная помарка показала, что GFP мессенджер РНК накапливается выше в листьях, выражаюх 35S GFP плюс 35S CMV2b или 35S GFP плюс 35S PSR1, чем в листьях, выражаюющих 35S GFP плюс EV. Агроинфильтрационный анализ был проведен для оценки распространения заглушающего сигнала в листьях двухнедельной саженцев Nicotiana bethamiana 16c. На 14 дней после инфильтрации, более 98% EV выставлены никаких очевидных GFP сигнализации в системных листьев.
В то время как CMV2b и PSR1 эффективно подавляли системное распространение заглушительного сигнала. Флуоресценция GFP наблюдалась примерно в 80% со-проникновения растений, а в остальных 20% протекаемых растений только с несколькими красными венами появились в недавно появившихся листьях. Этот метод прокладывает путь для исследователей, чтобы определить новые РНК заглушая супрессоры выделяется многими патогенами растений.
Сочетание растений и надлежащего OD является наиболее важной вещью, чтобы помнить при попытке этой процедуры. Следуя этой процедуре, функциональная характеристика супрессора глушителя РНК может быть выполнена для изучения механизма того, как эти супрессоры нажимают на геем РНК и что такое выход. Пожалуйста, носите защитные очки, когда вы проникаете растений, а также носить латексные перчатки во время всех шагов эксперимента.
