Bu yöntem, bitki patojenleri tarafından salgılanan RNA susturucuları ekran hakkında anahtar soruları cevaplamak için yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, RNA susturucuları tanımlaması için hızlı, doğru ve kapsamlı bir tarama testi sağlamaktır. 20 dakika boyunca 120 santigrat derecede %50 turba yosunu, %30 perlit ve %20 vermikülit ve otoklavdan oluşan çömlekçilik toprak karışımlarını hazırlayın.
Otoklavlı toprağın litrebaşına bir gram bitki gübresi çözeltisi ile karıştırılması ve daha büyük bir tepside saklanan daha küçük kaplara paketleyin. Her potun toprak yüzeyine Nicotiana bethamiana 16c bir veya iki tohum ekin. Plastik bir kubbe ile tepsi kapağı ve tohumlar çimlenmesağlar.
Tepsiyi 23 ila 25 derece sıcaklık, %50 ila %60 bağıl nem ve uzun bir günlük fotoperi ile ışık ve sıcaklık kontrollü büyüme odalarının altına yerleştirin. 3-4 gün sonra tohumlar çimlenir. Plastik kubbeyi çıkarve fidelerin çimlenme adımında kullanılan koşullarda büyümesini bekleyin.
Her 2-3 günde bir, uygun miktarda su ekleyin toprağı nemli tutarak ama ıslatmamayı. Her 10 günde bir, daha fazla büyüme teşvik etmek için gübre ekleyin. Bitkiler görünür aksilla veya çiçek tomurcukları ile en az beş tam gelişmiş gerçek yaprakları ve yaprakları sağlıklı bir yeşil görünüme sahip olana kadar normal şartlar altında Nicotiana bethamiana 16c bitkiler koruyun.
Sistemik RNA susturma tahlilleri ve yerel RNA susturma tahlilleri için Nicotiana bethamiana 16c'nin 3-4 haftalık yaprakları için 10 ila 14 günlük Nicotiana bethamiana 16c bitkilerini kullanın. LB plaka olumlu bir koloni almak ve mililitre Kanamisin başına 50 mikrogram ve mililitre Rifampicin başına 50 mikrogram ile desteklenen LB orta beş mililitre içeren bir cam tüp içine hücreleri aşılamak için bir ipucu kullanın. 24 ila 48 saat boyunca 200 RPM sallayarak 30 santigrat derecede hücreleri büyütün.
Aynı antibiyotikler ile desteklenen LB orta beş mililitre içine kültürün 100 mikrolitre transfer, pH 10 milimolar MES 5.6, ve 20 mikromolar AS. 16 ila 20 saat boyunca 200 RPM sallayarak 30 santigrat derecede bakteri büyümek. Hücreleri 4,000 kez g'de 10 dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve 10 milimolar magnezyum klorür tampon iki mililitre pelet resuspend.
Antibiyotiklerin tamamen çıkarılmasını sağlamak için yıkamayı tekrarlayın. 600 nanometre optik yoğunluğu ölçerek Agrobacterium kültürünün yoğunluğunu belirleyin. 10 milimolar magnezyum klorür tampon ile hücre kültürünü 1,5 ila 2,0 od 600 ayarlayın.
Son süspansiyon kültürüne pH 5.6 ve 150 mikromolar AS'de 10 milimolar MES ekleyin ve hücreleri en az üç saat boyunca sallayarak oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. 35S yeşil floresan protein içeren bir Agrobacterium kültürünün eşit hacimli lerini 35S salatalık mozaik virüs bastırıcı 2b, putatif efektör veya boş vektör içeren bir Agrobacterium kültürü ile karıştırın. Bir mililitre iğnesiz şırınga kullanarak, dikkatle ve yavaş yavaş Nicotiana bethamiana 16c yapraklarının eksenel tarafında karışık Agrobacterium süspansiyonlar sızma.
Yumuşak doku mendilleri ile yapraklarıkalan bakteriyel süspansiyon çıkarın ve bir marker kalem ile sızmış yamalar marjları daire. Üç ila dört gün post-infiltrasyon, görsel yaprakların sızmış yamalar GFP floresan tespit etmek için uzun bir dalga ultraviyole lamba kullanın. İki hafta sonra infiltrasyon, sistemik RNA susturma için tüm bitkinin yeni yetişen yaprakları tespit etmek için lamba kullanın.
Toplam RNA'yı yaprak dokusundan 4-7 gün sonra infiltrasyondan izole etmek için, sızmış Nicotiana bethamiana 16c yamaları bir harç içine yaprak dokuları toplamak. Harç içine sıvı nitrojen yerleştirin ve bir taşlama çubuğu ile ince bir toz içine doku eziyet ve steril bir iki mililitretüp için toz aktarın. RNA izolasyon reaktifini 100 miligramlık doku başına bir mililitre hacmine bir başlıktaki örnek tüpe, homojenate girdap ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.
Kaputtaki her tüpe bir mililitre RNA izolasyon reaktifi başına 200 mikrolitre lik hacimde kloroform ekleyin, 15 saniye boyunca şiddetle çalkalayın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatın. Homojeni 12,000 kez g'de 15 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Supernatant'ı yeni bir RNase-free tüpüne aktarın ve peleti atın.
Supernatant için 0,7 hacimli isopropanol ekleyin, yavaşça birkaç kez ters, ve oda sıcaklığında karışımı kuluçka 10 dakika. RNA peletini 12,000 kez g'de 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüj ile çökeltin. Supernatant atın.
Peleti %70 etanol ile yıkayın ve peleti bir başlıkta hava kurutun. 10 ila 20 dakika boyunca 65 derece santigrat su banyosunda kuluçka yada katarak metil pirokarbonat arıtılmış suda RNA çözün. GFP messenger RNA düzeylerinin Kuzey leke analizini gerçekleştirmek için, 1X MOPS çalışan tampon bir% 1.2 formaldehit denaturing agarose jel hazırlamak.
RNA'yı bire bir, RNA yükleme boyasıyla karıştırın ve RNA'yı 65 derecede 10 dakika kuluçkaya yatarak denatüre edin. Denatüre edilmiş örnekleri buzüzerinde bir dakika soğutun. Bir pipet ile, RNA iyi ayrılana kadar 50 dakika boyunca 100 volt jel ve elektroforkuyuiçine örnekleri yükleyin.
Formaldehit kaldırmak için 20X tuzlu sodyum sitrat tampon içine jel durulamak. 20X tuzlu sodyum sitrat tampon, kağıt havlu bir tabaka, ıslak Whatman kağıt, jel bir tabaka, naylon membran bir tabaka, ıslak Whatman kağıt iki kat, kuru Whatman kağıt, bir cam plaka ve bir ağırlık iki kat kurarak bir gecede kılcal transfer gerçekleştirin. Sabah, jel RNA naylon membran aktarılır.
Membranı 2X tuzlu sodyum sitratta ıslatın ve ıslak membranı UV crosslinking'e maruz bırakarak RNA'yı membrana sabitleyin. El yazmasına göre devam et. Üç ila dört haftalık Nicotiana bethamiana 16c bitkilerin tam gelişmiş yaprakları 35S GFP taşıyan Agrobacterium karışımları ile yamalar halinde co-sızmış edildi.
Dört gün sonra infiltrasyon sonrası, sızmış alanın GFP floresan doğal ışık ve uzun dalga UV ışığı altında görüntülendi. Kuzey leke GFP messenger RNA 35S GFP artı 35S CMV2b veya 35S GFP artı 35S PSR1 ifade yaprakları 35S GFP artı EV ifade daha yüksek birikmiş olduğunu ortaya koymuştur. İki haftalık Nicotiana bethamiana 16c fidelerinin yapraklarındaki susturma sinyalinin yayılmasını değerlendirmek için tarımsal filtrasyon analizi yapıldı. 14 gün sonra infiltrasyon sonrası, EV fazla% 98 sistemik yapraklarıbelirgin GFP sinyal gösterdi.
CmV2b ve PSR1 ise susturma sinyalinin sistemik yayılmasını etkin bir şekilde inhibe etti. GFP floresansı ortak sızmış bitkilerin yaklaşık %80'inde gözlendi ve yeni ortaya çıkan yapraklarda sadece birkaç kırmızı damar bulunan sızmış bitkilerin geri kalan %20'sinde gözlendi. Bu teknik, araştırmacıların birçok bitki patojeni tarafından salgılanan yeni RNA susturma baskılayıcılarını belirlemelerinin önünü açıyor.
Bitkilerin kombinasyonu ve uygun OD bu prosedürü çalışırken hatırlanması gereken en önemli şeydir. Bu yordamı takiben, RNA susturucunun fonksiyonel karakterizasyonu, bu bastırıcıların ana bilgisayar RNA susturucuya nasıl bastığının ve çıktının ne olduğunu araştırmak için yapılabilir. Lütfen bitkilere sızdığınızda güvenlik gözlüklerini takın ve tüm deneme adımları sırasında lateks eldivenleri de giyin.
