هذا البروتوكول يمكن أن يميز بوضوح أوضاع موت الخلايا الضامة أثناء العدوى الفطرية. من خلال مراقبة الأجنة المتعددة بالتوازي ، فإنه يزيد إلى حد كبير من احتمال التقاط عملية موت الخلايا الضامة بأكملها. ويمكن أيضا أن يطبق هذا البروتوكول على مراقبة موت الخلايا وغيرها من السلوك الخلوي في سيناريوهات مماثلة تنطوي على العدوى أو التهاب معقمة.
خلال التصوير الحي الممتد ، من المهم جدًا الحفاظ على شدة الليزر منخفضة قدر الإمكان لتجنب الإضاءة الضوئية والسمية. بعد تلقيح وفقا للمخطوطة، الطرد المركزي في 3000 مرات G مرات لمدة 10 دقائق لجمع مايجنومي البكتيريا كما بيليه. تجاهل جميع ما عدا 300 ميكرولترات من المابير، وإعادة تعليق بيليه.
إضافة ثلاثة ملليلتر من 7H9 المتوسطة مع 10٪ الجلسرين إلى مزيد من إعادة تعليق بيليه، ثم sonicate تعليق في حمام مائي في 100 واط، مع 15 ثانية على و 15 ثانية قبالة، لما مجموعه دقيقتين لتحقيق تجانس خلية واحدة. نقل تعليق بكتيرية إلى حقنة 10 ملليلتر، وتمرير من خلال مرشح خمسة ميكرون لإزالة أي كتل بكتيرية. باستخدام مقياس الطيفي، وقياس الكثافة البصرية للتعليق، وتمييع مع وسائل الإعلام 7H9 التي تحتوي على 10٪ الجلسرين إلى OD 600 في واحد.
تقسيم التعليق إلى 10 ميكرولتر aliquots، وتخزينها في السلبية 80 درجة مئوية الفريزر لمزيد من الاستخدام. أولاً، قم بسخين الأذانوز في كتلة تدفئة 95 درجة مئوية حتى تذوب تماماً. الحفاظ على agarose في شكل سائل عن طريق وضعه في كتلة التدفئة 45 درجة مئوية.
لتركيب للعدوى العضلية في منطقة الجذع، إنشاء طبقة agarose السفلية عن طريق صب 0.5 ملليلتر من وزن 1٪، من قبل حجم agarose بالتساوي على شريحة زجاجية. ضع الشريحة على صندوق الثلج أو سطح بارد لمدة ثلاث دقائق لترسيخ. بعد تخدير أجنة سمك الحمار الوحشي، ضع ما يصل إلى 60 جنيناً من أسماك الحمار الوحشي على طبقة أغاروز السفلية، ووضعها بعناية في صفين.
إزالة أي ماء المتبقية على طبقة agarose السفلي مع ورقة الأنسجة، قبل إضافة 0.3 ملليلتر من 0.5٪ الوزن من قبل حجم agarose لإنشاء الطبقة العليا. تأكد من أن الأجنة جزءا لا يتجزأ تماما في agarose. العودة الشريحة الزجاجية إلى icebox مرة أخرى لترسيخ agarose.
الحفاظ على الطبقة العليا من agarose رطبة من خلال تغطية السطح مع إضافية E3 البيض الماء. المقبل، وضبط الحقن المجهري وmicromanipulator إلى الوضع المناسب والإعداد للمجهر. نقل ثلاثة microliters من الثقافة البكتيرية المعدة في إبرة المعدة باستخدام microloader.
الماصات ببطء وبعناية لتجنب تشكيل فقاعات الهواء. حقن 100 CFU في منطقة الجذع. بعد الحقن المجهري، قم بتدفيق أجنة أسماك الحمار الوحشي بعناية في ماء البيض الطازج مع ماصة بلاستيكية.
لتركيب لعدوى منتصف القرن، واستخدام ماصة بلاستيكية لنقل أربعة إلى ستة الأجنة تريكين تخدير في agarose. ضع رأس كل جنين إلى الأعلى بعناية بإبرة من 10 قياس. بمجرد إصلاح جميع أوضاع الأجنة، قم بنقل الشريحة الزجاجية إلى صندوق جليدي أو سطح بارد للسماح للأغاروز بالتوطد.
حقن 500 CFU في منتصف الفقر. بعد الحقن المجهري، قم بتدفيق أجنة سمك الحمار الوحشي بعناية في ماء البيض الطازج مع ماصة بلاستيكية. بمجرد أن تتوطد agarose تماما، وتغطي agarose مع طبقة من ماء البيض.
بعد إنشاء الغرفة البيئية، ضع طبق القاع الزجاجي 35 ملليمتر مع سمك الحمار الوحشي في الغرفة البيئية. فتح 405 الصمام الثنائي، الأرجون في 20٪ السلطة، وDPSS 561 نانومتر الليزر. قم بإعداد طاقة الليزر المناسبة في إعدادات الطيف.
اختر وضع الاكتساب المتسلسل للمسح الضوئي XYZ، ثم قم بتعيين تنسيق الصور إلى 512 بكسل في 512 بكسل. قم بالتبديل إلى وضع البيانات الحية، واستهداف موضع الحمار الوحشي الأول، ووضع علامة على وضعي البداية والنهاية Z. كرر هذه العملية لكل من الأجنة المتبقية.
إضافة وقفة في نهاية البرنامج. تعريف حلقة ودورة البرنامج، وحفظ الملف. في هذه الدراسة، استخدمنا coro1a المعدلة وراثيا ذكرت سابقا: eGFP؛ lyzDsRed2، وmpeg1loxP المعدلة وراثيا؛ DsRed:loxPeGFP؛ lyz:eGFP، للتمييز بين الضامة والعدلات في الجسم الحي.
أصبح الضامة المنهمكة بشكل كبير مع البكتيريا مستديرة وعرضها انخفاض الحركة ، مع تورم سيتوبلازميك في نهاية المطاف ، وتمزق غشاء الخلية ، والنشر السريع للمحتوى السيتوبلازمي. وأظهرت الضامة الأشعة فوق البنفسجية المشعة نموذجية الأنماط الظاهرية الخلية المبرمج مثل انكماش الخلية، والتجزئة النووية، والتكثيف الكروماتين. ولوحظ أيضا أن الضامة تعمل بنشاط على إنارة وجرى نشرها في M.merinum.
ومع ذلك ، كان العدلات محدودة القدرة البلعومية ، وسرعان ما خضعت للوفاة الخلوية دون engorgement البكتيرية واضحة. يمكن لهذا البروتوكول، إلى جانب أدوات تحرير الجينات القوية، توفير منصة فعالة لمزيد من الفهم لتأثير مجموعة متنوعة من العوامل على التفاعل بين المضيف والمسببات في الجسم الحي.
