Este protocolo puede diferenciar claramente los modos de muerte celular de macrófagos durante la infección micobacteriana. Al observar múltiples embriones en paralelo, aumenta en gran medida la probabilidad de capturar todo el proceso de muerte celular lítica de macrófagos. Este protocolo también se puede aplicar a la observación de la muerte celular y otros comportamientos celulares en escenarios similares que implican infección o inflamación estéril.
Durante la toma de imágenes en vivo extendida, es muy importante mantener la intensidad del láser lo más baja posible para evitar el fotoblanqueo y la toxicidad. Después de la inoculación según el manuscrito, centrifugar la cultura a 3000 veces G durante 10 minutos para recoger el Mycobacterium marinum como un pellet. Deseche todos los microlitros del sobrenadante y vuelva a suspender el pellet.
Añadir tres mililitros de medio 7H9 con 10%glicerol para volver a suspender aún más el pellet, y luego sonicar la suspensión en un baño de agua a 100 vatios, con 15 segundos encendido y 15 segundos de descuento, durante un total de dos minutos para lograr un homogeneización de una sola célula. Transfiera la suspensión bacteriana a una jeringa de 10 mililitros y pase a través de un filtro de cinco micras para eliminar cualquier gruma bacteriana. Usando un espectrofotómetro, mida la densidad óptica de la suspensión y diluya con medios 7H9 que contengan 10% de glicerol a OD 600 a la vez.
Divida la suspensión en 10 alícuotas de microlitros y guárdela en un congelador negativo de 80 grados Centígrados para su uso posterior. En primer lugar, calentar la agarosa en un bloque de calentamiento de 95 grados Celsius hasta que se derrita por completo. Mantener la agarosa en forma líquida colocándola en un bloque de calentamiento de 45 grados Celsius.
Para montar para la infección intramuscular en la región del tronco, cree la capa de agarosa inferior vertiendo 0,5 mililitros de 1% de peso en volumen agarrose uniformemente en un portaobjetos de vidrio. Coloque la diapositiva sobre una nevera o una superficie fría durante tres minutos para solidificarse. Después de anestesiar los embriones de pez cebra, coloque hasta 60 embriones de pez cebra en la capa de agarosa inferior, y los coloque cuidadosamente en dos filas.
Retire el agua restante en la capa de agarosa inferior con papel tisú, antes de agregar 0,3 mililitros de 0,5% de peso por volumen de agarosa para crear la capa superior. Asegúrese de que los embriones estén completamente incrustados en la agarosa. Vuelva a colocar el portaobjetos de vidrio en la nevera para solidificar la agarosa.
Mantenga húmeda la capa superior de la agarosa cubriendo la superficie con agua de huevo E3 adicional. A continuación, ajuste el microinyector y el micromaniprógrafo a la posición y ajuste adecuados para la microinyección. Transfiera tres microlitros de cultivo bacteriano preparado a la aguja preparada utilizando un microcargador.
Pipetear lentamente y cuidadosamente para evitar la formación de burbujas de aire. Inyecte 100 UFC en la región troncal. Después de la microinyección, enjuague cuidadosamente los embriones de peces cebra en agua fresca de óvulo con una pipeta de plástico.
Para montar para la infección de cerebro medio, utilice una pipeta de plástico para transferir los cuatro a seis embriones anesthetizados con tricaína a la agarosa. Coloque la cabeza de cada embrión hacia arriba cuidadosamente con una aguja de calibre 10. Una vez que todas las posiciones de los embriones estén fijas, transfiera el portaobjetos de vidrio a una nevera o superficie fría para dejar que la agarosa se solidifique.
Inyectar 500 UFC en el cerebro medio. Después de la microinyección, enjuague cuidadosamente los embriones de pez cebra en agua de huevo fresco con una pipeta de plástico. Una vez que la agarosa se haya solidificado por completo, cubra la agarosa con una capa de agua de huevo.
Después de configurar la cámara ambiental, coloque el plato inferior de cristal de 35 milímetros con el pez cebra en la cámara ambiental. Abra el diodo 405, el argón a una potencia del 20% y el láser de nanómetro DPSS 561. Configure la potencia láser adecuada en los ajustes de espectro.
Elija el modo de adquisición de escaneo secuencial XYZ y establezca el formato de imágenes en 512 por 512 píxeles. Cambie al modo de datos en vivo, apunte a la posición del primer pez cebra y marque la posición Z de inicio y fin. Repita este proceso para cada uno de los embriones restantes.
Agregue una pausa al final del programa. Defina el bucle y el ciclo del programa y guarde el archivo. En este estudio, utilizamos previamente coro1a transgénica:eGFP;lyzDsRed2, y mpeg1loxP transgénico;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, para distinguir los macrófagos y los neutrófilos in vivo.
Un macrófago fuertemente engordado con bacterias se volvió redondo y mostró una motilidad reducida, con hinchazón citoplasmática eventual, ruptura de la membrana celular y rápida diseminación del contenido citoplasmático. Los macrófagos irradiados por UV mostraron fenotipos típicos de células apoptóticas como la contracción celular, la fragmentación nuclear y la condensación de cromatina. También se observaron los macrófagos activamente fagocitosos y diseminados M.merinum.
Sin embargo, los neutrófilos tenían una capacidad fagocítica limitada, y rápidamente se sometieron a muerte celular lítica sin engorgemento bacteriano obvio. Combinado con potentes herramientas de edición génica, este protocolo puede proporcionar una plataforma eficaz para comprender mejor el efecto de una variedad de factores en la interacción huésped-patógeno in vivo.
