Este protocolo pode claramente diferenciar os modos de morte celular macrófago durante a infecção micobacteriana. Observando múltiplos embriões em paralelo, aumenta muito a probabilidade de capturar todo o processo de morte celular macfago. Este protocolo também pode ser aplicado à observação da morte celular e outros comportamentos celulares em cenários semelhantes envolvendo infecção ou inflamação estéril.
Durante a imagem ao vivo estendida, é muito importante manter a intensidade do laser o mais baixo possível para evitar fotobleaching e toxicidade. Após a inoculação de acordo com o manuscrito, centrifugar a cultura a 3000 vezes G por 10 minutos para coletar o Mycobacterium marinum como uma pelota. Descarte todos, exceto 300 microliters do supernante, e suspenda a pelota.
Adicione três mililitros de meio 7H9 com 10% de glicerol para suspender ainda mais a pelota e, em seguida, sonicar a suspensão em um banho de água a 100 watts, com 15 segundos ligados e 15 segundos de desconto, por um total de dois minutos para conseguir uma única célula homogeneate. Transfira a suspensão bacteriana para uma seringa de 10 mililitros e passe por um filtro de cinco mícrons para remover qualquer aglomerado bacteriano. Usando um espectótmetro, meça a densidade óptica da suspensão e dilui-a com mídia 7H9 contendo 10% de glicerol a OD 600 em um.
Divida a suspensão em 10 alíquotas de microliter e armazene no congelador negativo de 80 graus Celsius para uso posterior. Primeiro, aqueça a ága em um bloco de aquecimento de 95 graus Celsius até que esteja completamente derretido. Mantenha a agarose em forma líquida colocando-a em um bloco de aquecimento de 45 graus Celsius.
Para montar para infecção intramuscular na região do tronco, crie a camada inferior de agarose derramando 0,5 mililitros de 1% de peso em volume agarose uniformemente em um escorregador de vidro. Coloque o slide em uma geladeira ou superfície fria por três minutos para solidificar. Depois de anestesiar os embriões de zebrafish, coloque até 60 embriões de zebrafish na camada inferior de agarose, e coloque-os cuidadosamente em duas linhas.
Remova qualquer água restante na camada inferior de agarose com papel de tecido, antes de adicionar 0,3 mililitros de 0,5% de peso por volume agarose para criar a camada superior. Certifique-se de que os embriões estão completamente incorporados na agarose. Devolva o deslizamento de vidro para a geladeira novamente para solidificar a agarose.
Mantenha a camada superior da agarose úmida cobrindo a superfície com água extra de ovo E3. Em seguida, ajuste o microinjetor e o micromanipulador à posição adequada e configuração para microinjeção. Transfira três microliters de cultura bacteriana preparada para a agulha preparada usando um microcarregador.
Pipeta devagar e cuidadosamente para evitar formar bolhas de ar. Injete 100 UFC na região do tronco. Após a microinjeção, lave cuidadosamente os embriões de peixes-zebra em água de ovo fresco com uma pipeta plástica.
Para montar para a infecção do cérebro médio, use uma pipeta plástica para transferir os quatro para seis embriões tricaine-anesthetizados para a ágarose. Posicione a cabeça de cada embrião para cima cuidadosamente com uma agulha de calibre 10. Uma vez que todas as posições dos embriões sejam fixas, transfira o deslizamento de vidro para uma geladeira ou superfície fria para deixar a agarose solidificar.
Injete 500 UFC no cérebro médio. Após a microinjeção, lave cuidadosamente os embriões de zebrafish em água de ovo fresco com uma pipeta plástica. Uma vez que a agarose tenha se solidificado completamente, cubra a agarose com uma camada de água de ovo.
Após a instalação da câmara ambiental, coloque o prato de fundo de vidro de 35 milímetros com o zebrafish na câmara ambiental. Abra o diodo 405, o argônio com 20% de potência e o laser DPSS 561 nanômetro. Configure a potência laser apropriada nas configurações do espectro.
Escolha o modo de aquisição de varredura sequencial XYZ e defina o formato de imagens para 512 por 512 pixels. Mude para o modo de dados ao vivo, direja a posição do primeiro zebrafish e marque a posição Z de início e fim. Repita este processo para cada um dos embriões restantes.
Adicione uma pausa no final do programa. Defina o loop e o ciclo do programa e salve o arquivo. Neste estudo, utilizamos coro1a transgênico relatado anteriormente:eGFP;lyzDsRed2, e mpeg1loxP transgênico;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, para distinguir os macrófagos e os neutrófilos in vivo.
Um macrófago fortemente engorgado com bactérias tornou-se redondo e exibiu motilidade reduzida, com eventual inchaço citoplasmado, ruptura da membrana celular e rápida disseminação do conteúdo citoplasmado. Macrófagos irradiados por UV mostraram fenótipos típicos de células apoptóticas, como encolhimento celular, fragmentação nuclear e condensação de cromatina. Observou-se também que os macrófagos phacytos ativamente phagocytosed e disseminado M.merinum.
No entanto, os neutrófilos tinham capacidade fagocítica limitada, e rapidamente sofreram morte celular lítica sem engorgement bacteriano óbvio. Combinado com poderosas ferramentas de edição de genes, este protocolo pode fornecer uma plataforma eficaz para entender melhor o efeito de uma variedade de fatores na interação host-pathogen in vivo.
