פרוטוקול זה יכול להבדיל בבירור מצבי מוות של תאי מקרופאג במהלך זיהום mycobacterial. על ידי התבוננות בעוברים מרובים במקביל, זה מגדיל מאוד את ההסתברות ללכוד את כל תהליך המוות של תאים ליטיק מקרופאגים. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם גם על תצפית של מוות תאי והתנהגות תאית אחרת בתרחישים דומים מעורבים זיהום או דלקת סטרילית.
במהלך ההדמיה החיה המורחבת, חשוב מאוד לשמור על עוצמת הלייזר נמוכה ככל האפשר, כדי למנוע פוטובלאצ'ים ורעילות. לאחר החיסון על פי כתב היד, צנטריפוגה התרבות ב 3000 פעמים G במשך 10 דקות כדי לאסוף את Marinum Mycobacterium כמו גלולה. השלך את כל המיקרוליטרים מלבד 300 של העל-טבעי, והשהה מחדש את גלולת הכדור.
הוסף שלושה מיליליטר של מדיום 7H9 עם 10% גליצרול כדי להשעות מחדש את גלולה, ולאחר מכן sonicate ההשעיה באמבט מים ב 100 וואט, עם 15 שניות על ו 15 שניות, במשך סך של שתי דקות כדי להשיג הומוגניאט תא אחד. מעבירים את ההשעיה החיידקית למזרק 10 מיליליטר, ועוברים דרך מסנן חמישה מיקרון כדי להסיר גושים חיידקיים. באמצעות ספקטרופוטומטר, למדוד את הצפיפות האופטית של ההשעיה, ולדלל אותו עם מדיה 7H9 המכיל 10%גליצרול כדי OD 600 בבת אחת.
מחלקים את ההשעיה ל-10 מיליקוטים מיקרוליטרים, ומאחסנים במקפיא שלילי של 80 מעלות למשך שימוש נוסף. ראשית, מחממים את ההתעוררות בבלוק חימום של 95 מעלות צלזיוס עד שהוא נמס לחלוטין. לשמור על agarose בצורה נוזלית על ידי הצבת אותו בלוק חימום 45 מעלות צלזיוס.
כדי לעלות על זיהום תוך שרירי באזור תא המטען, ליצור את שכבת אגרוז התחתון על ידי שפיכת 0.5 מיליליטר של 1% משקל לפי נפח התעורר באופן שווה על מגלשת זכוכית. מניחים את השקופית על קופסת קרח או משטח קר במשך שלוש דקות כדי לחזק. לאחר הרדמה של עוברי הזברה, מניחים עד 60 עוברי זברה על שכבת אגרוז התחתונה, ומניחים אותם בזהירות בשתי שורות.
הסר את כל המים הנותרים על שכבת אגרוז התחתונה עם נייר טישו, לפני הוספת 0.3 מיליליטר של 0.5% משקל לפי נפח התעוררה כדי ליצור את השכבה העליונה. ודא כי העוברים מוטבעים לחלוטין אגרוז. החזירו שוב את מגלשת הזכוכית לארגז הקרח כדי לחזק את ההתעוררות.
שמור על השכבה העליונה של אגרוז לח על ידי כיסוי פני השטח עם מי ביצה E3 נוספים. לאחר מכן, להתאים את microinjector ו micromanipulator למיקום הנכון והגדרה עבור microinjection. מעבירים שלושה מיקרוליטרים של תרבות חיידקים מוכנה לתוך המחט המוכנה באמצעות מיקרו-מטען.
פיפטה לאט ובזהירות כדי למנוע יצירת בועות אוויר. להזריק 100 CFU לאזור תא המטען. לאחר microinjection, בזהירות לשטוף את העוברים דג זברה לתוך מי ביצה טריים עם פיפטה פלסטיק.
כדי לעלות על זיהום midbrain, להשתמש פיפטה פלסטיק להעביר את ארבעה עד שישה עוברים הרדמה tricaine לתוך אגרוז. מקם את הראש של כל עובר כלפי מעלה בזהירות עם מחט 10-מד. לאחר שכל תנוחות העוברים קבועות, מעבירים את מגלשת הזכוכית לארגז קרח או למשטח קר כדי לאפשר לאפרוז להתגבש.
להזריק 500 CFU לתוך האמצע. לאחר microinjection, בזהירות לשטוף את העוברים זברהפיש לתוך מי ביצה טריים עם פיפטה פלסטיק. לאחר שהתעוררות התגבשה לחלוטין, מכסים את ההתעוררות בשכבה של מי ביצה.
לאחר הקמת התא הסביבתי, מניחים את המנה התחתונה זכוכית 35 מילימטר עם דג הזברה בתא הסביבתי. פתח את הדיודה 405, ארגון ב 20% כוח, ו DPSS 561 לייזר ננומטר. הגדר את כוח הלייזר המתאים בהגדרות הספקטרום.
בחרו במצב רכישת סריקה רציפה של XYZ והגדירו את תבנית התמונות ל-512 על 512 פיקסלים. עבור למצב נתונים חיים, כוון למיקום של דג הזברה הראשון וסמן את מיקום התחלה וסיום Z. חזור על תהליך זה עבור כל אחד מהעוברים הנותרים.
הוסף השהיה בסוף התוכנית. הגדר את הלולאה והמחזור של התוכנית ושמור את הקובץ. במחקר זה, השתמשנו בעבר דיווחו coro1a מהונדס:eGFP;lyzDsRed2, ו mpeg1loxP מהונדס;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, כדי להבחין מקרופאגים ואת נויטרופילים במבחנה.
מקרופאג' שקוע בכבדות בחיידקים הפך עגול והפגין תנועתיות מופחתת, עם נפיחות ציטופלסמית בסופו של דבר, קרע של קרום התא, והפצה מהירה של התוכן הציטופלסמי. מקרופאגים מוקרנים UV הראו פנוטיפים אופייניים לתאי אפטומטיים כגון התכווצות תאים, פיצול גרעיני ועיבוי כרומטין. הוא גם נצפה המקרופאגים פעילים phagocytosed והפיץ M.merinum.
עם זאת, נויטרופילים היו בעלי יכולת phagocytic מוגבלת, ועבר במהירות מוות תאי ליטיק ללא engorgement חיידקי ברור. בשילוב עם כלים רבי עוצמה לעריכת גנים, פרוטוקול זה יכול לספק פלטפורמה יעילה להבנה נוספת של ההשפעה של מגוון גורמים על אינטראקציה בין מארח לפתוגן ב- vivo.
