Dieses Protokoll kann Makrophagenzell-Todesmodi während einer mykobakteriellen Infektion deutlich unterscheiden. Durch die parallele Beobachtung mehrerer Embryonen erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, den gesamten makrophagenlytischen Zelltodprozess zu erfassen, erheblich. Dieses Protokoll kann auch auf die Beobachtung des Zelltodes und anderen zellulären Verhalten in ähnlichen Szenarien mit Infektion oder sterile Entzündung angewendet werden.
Während der erweiterten Live-Bildgebung ist es sehr wichtig, die Intensität des Lasers so gering wie möglich zu halten, um Photobleichungen und Toxizität zu vermeiden. Nach der Impfung nach dem Manuskript zentrifugieren Sie die Kultur bei 3000 mal G für 10 Minuten, um das Mycobacterium marinum als Pellet zu sammeln. Entsorgen Sie alle bis auf 300 Mikroliter des Überstandes, und setzen Sie das Pellet wieder auf.
Fügen Sie drei Milliliter 7H9 Medium mit 10% Glycerin, um das Pellet weiter aufzuhängen, und beschallen Sie dann die Suspension in einem Wasserbad mit 100 Watt, mit 15 Sekunden auf und 15 Sekunden aus, für insgesamt zwei Minuten, um ein einzelnes Zellhomogenat zu erreichen. Übertragen Sie die bakterielle Suspension auf eine 10-Milliliter-Spritze und durchlaufen Sie einen Fünf-Mikron-Filter, um alle bakteriellen Klumpen zu entfernen. Messen Sie mit einem Spektralphotometer die optische Dichte der Suspension und verdünnen Sie sie mit 7H9-Medien, die 10% Glycerin bis OD 600 enthalten.
Teilen Sie die Suspension in 10 Mikroliter Aliquots, und speichern Sie bei negativen 80 Grad Celsius Gefrierschrank für die weitere Verwendung. Zuerst erhitzen Sie die Agarose in einem 95 Grad Celsius Heizblock, bis sie vollständig geschmolzen ist. Bewahren Sie die Agarose in flüssiger Form auf, indem Sie sie in einen 45 Grad Celsius Heizblock legen.
Um für intramuskuläre Infektionen im Rumpfbereich zu montieren, erstellen Sie die untere Agaroseschicht, indem Sie 0,5 Milliliter von 1% Volumen-Agarose gleichmäßig auf einen Glasschlitten gießen. Legen Sie die Folie drei Minuten lang auf eine Eisbox oder eine kalte Oberfläche, um sie zu erstarren. Nach der Anästhesisierung der Zebrafisch-Embryonen bis zu 60 Zebrafisch-Embryonen auf die untere Agaroseschicht legen und sorgfältig in zwei Reihen auslegen.
Entfernen Sie das verbleibende Wasser auf der unteren Agaroseschicht mit Tissuepapier, bevor Sie 0,3 Milliliter mit 0,5% Volumen-Agarose hinzufügen, um die obere Schicht zu erstellen. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen vollständig in die Agarose eingebettet sind. Geben Sie die Glasrutsche wieder in die Eisbox zurück, um die Agarose zu erstarren.
Halten Sie die obere Schicht der Agarose feucht, indem Sie die Oberfläche mit zusätzlichem E3-Eiwasser bedecken. Passen Sie als Nächstes den Mikroinjektor und den Mikromanipulator an die richtige Position und Einstellung für die Mikroinjektion an. Übertragen Sie drei Mikroliter vorbereiteter Bakterienkultur mit einem Mikrolader in die vorbereitete Nadel.
Pipette langsam und vorsichtig, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Injizieren Sie 100 KBE in den Stammbereich. Nach der Mikroinjektion die Zebrafischembryonen vorsichtig mit einer Kunststoffpipette in frisches Eiwasser spülen.
Um für die Midbrain-Infektion zu montieren, verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um die vier bis sechs tricain-anesthetisierten Embryonen in die Agarose zu übertragen. Positionieren Sie den Kopf jedes Embryos vorsichtig mit einer 10-Spur-Nadel nach oben. Sobald alle Embryopositionen fixiert sind, übertragen Sie die Glasrutsche auf eine Eisbox oder kalte Oberfläche, um die Agarose erstarren zu lassen.
Injizieren Sie 500 CFU in das Mittelhirn. Nach der Mikroinjektion die Zebrafisch-Embryonen vorsichtig mit einer Plastikpipette in frisches Eiwasser spülen. Sobald die Agarose vollständig verfestigt ist, bedecken Sie die Agarose mit einer Schicht Eiwasser.
Nach dem Aufstellen der Umweltkammer die 35 Millimeter Glasbodenschale mit dem Zebrafisch in die Umweltkammer geben. Öffnen Sie die 405 Diode, Argon mit 20% Leistung und DPSS 561 Nanometer Laser. Richten Sie die entsprechende Laserleistung in Denfunkeinstellungen ein.
Wählen Sie den XYZ-Sequenzienscanerfassungsmodus aus, und legen Sie das Bildformat auf 512 x 512 Pixel fest. Wechseln Sie in den Live-Datenmodus, zielen Sie auf die Position des ersten Zebrafisches ab und markieren Sie die Start- und End-Z-Position. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der verbleibenden Embryonen.
Fügen Sie am Ende des Programms eine Pause hinzu. Definieren Sie die Schleife und den Zyklus des Programms, und speichern Sie die Datei. In dieser Studie haben wir zuvor gemeldete transgene coro1a:eGFP;lyzDsRed2 und transgene mpeg1loxP;DsRed:loxPeGFP;lyz:eGFP, verwendet, um die Makrophagen und die Neutrophilen in vivo zu unterscheiden.
Ein Makrophagen, das stark mit Bakterien vermischt war, wurde rund und zeigte eine reduzierte Beweglichkeit, mit eventuellen zytoplasmatischen Schwellungen, Bruch der Zellmembran und schneller Verbreitung des zytoplasmatischen Gehalts. UV-bestrahlte Makrophagen zeigten typische apoptotische Zellphänotypen wie Zellschrumpfung, Kernfragmentierung und Chromatinkondensation. Es wurde auch beobachtet, die Makrophagen aktiv phagozytosed und verbreitet M.merinum.
Jedoch, Neutrophile hatten begrenzte phagozytische Fähigkeit, und schnell unterzog lytische Zelltod ohne offensichtliche bakterielle Engorgement. In Kombination mit leistungsstarken Gen-Editing-Tools kann dieses Protokoll eine effektive Plattform bieten, um die Auswirkungen einer Vielzahl von Faktoren auf die Wirts-Pathogen-Interaktion in vivo weiter zu verstehen.
