يصف بروتوكولنا استخدام الأصباغ التقليدية في نظام الـ BODIPY للمجهر فائق الدقة باستخدام حالاتها المتفرقة ذات التحول الأحمر. وهذا يمكننا من دراسة العضيات والجزيئات الحيوية في الخلايا الحية مع قرار 30 نانومتر. وميزة هذه الطريقة هي بساطتها وتعدد استخدامات مختلف المرافقات المُتاحة من قبل BODIPY التي توفر مصدرًا طويل الأمد لإشارات الجزيء الواحد.
يمكن أن يصبح تطبيقنا البرهان مهمًا للحصول على رؤى في أمراض مثل مرض الكبد الدهني أو داء السكري من النوع 2 عن طريق حل قطرات الدهون والأحماض الدهنية دون حد الحيود. نحن اكتساب نظرة ثاقبة في الأحماض الدهنية والدهون والبيولوجيا قطرات في خلايا الخميرة والثدييات. ومع ذلك، هذه التقنية قابلة للتطبيق على كافة أنواع الخلايا الشفافة الأخرى ذات الفلورية الخلفية المنخفضة.
عند استخدام تكنيك للمرة الأولى، تأكد من تحسين تركيزات دي وقوى الليزر، لمراقبة إشارات جزيء واحد مشرق. مظاهرة بصرية من هذا technic المهم أن نرى كيف تركيز دي والتحسين من نتائج قوة الليزر في إشارات جزيء واحد مشرق. الحفاظ على خلايا الثدييات U2OS في DMBM غير فلورية مع 10٪ مصل الأبقار الجنينية أربعة الجلوتامين المليمولار, واحد الصوديوم المليمولار بيروفات, واحد في المئة المضادات الحيوية بكتيريا البنسيلين في قارورة T-25.
تقسيم الخلايا في 70 إلى 80٪ التقاء إلى واحد إلى خمسة، والماصات في بئر واحد من ثمانية لوحة جيدا. تغيير الخلايا في لوحة ثمانية جيدا لمدة 12 إلى 24 ساعة. قبل عشر دقائق من التصوير، إضافة خضراء من نوع "Lysotracker" من نوع "بوديبي-C12" أو "مترافق" مع "بوديبي" (BODIPY) تضاف تركيز نهائي من 100 نانومولار.
قم بتركيب مجموعات التصفية المناسبة في مسار الانبعاثات بناءً على لون الانبعاثات من "BODIPY" المستخدم. تشغيل المجهر. مرحلة المجهر، 488 نانومتر وأشعة الليزر 561 نانومتر، فضلا عن الكاميرا.
إضافة قطرة من النفط الناشئة على الهدف المجهر. افتح برنامج HAL4000 الذي يتحكم في ضوء LED للتصوير الميداني الساطع وقوى الليزر ومصاريع الليزر وإعدادات الكاميرا للتصوير. تعيين مكاسب EMCCD إلى 30 ودرجة حرارة الكاميرا إلى ناقص 68 درجة مئوية.
إعداد الكاميرا والبرامج المقابلة لتسجيل الأفلام في 20 هيرتز. بدوره على سخان مرحلة المجهر وتعيينه إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية وإلى مستوى ثاني أكسيد الكربون من خمسة في المئة. ضبط لون التصحيح الموضوعي وفقا لذلك.
قم بتركيب العينة على مرحلة المجهر والتركيز البؤري حتى يشارك نظام التركيز. حرك المرحلة باستخدام وحدة تحكم المرحلة حتى تظهر الخلايا السليمة في مجال الرؤية. تحميل تسلسل مصراع الليزر لإثارة مونوموس وكذلك المخاتم، الذين قوة الليزر من الليزر 561 نانومتر إلى ما بين 821 كيلوواط لكل سنتيمتر مربع لمجهر توطين جزيء واحد، بحيث، يتم الكشف عن مسام الفلورانس جزيء واحد في قناة الانبعاثات الحمراء التحول.
ضبط قوة الليزر بين النقطة 035 ونقطة 07 واط لكل سنتيمتر مربع ليزر 488 نانومتر، بحيث يظهر الفلورس التقليدي في قناة الانبعاثات الخضراء. اختر مجلد وجهة للأفلام وسجل إطارات الاستحواذ من 5000 إلى 20000 لتجميع تعريبات كافية لإعادة إنشاء صور فائقة الدقة. الانتقال إلى حقول مختلفة من العرض والتكرار لتجميع البيانات لمزيد من الخلايا.
قم بتحميل الفيلم في برنامج تحليل المجهر لتوطين جزيء واحد. بصريا شاشة الفيلم وضبط إعدادات التباين، بحيث وميض الفلورسنت جزيء واحد مرئيا. لتعيين ثوابت تحديد جزيء واحد لتركيب 2D Gaussian، PSFs.
بصريا الشاشة من خلال بعض الإطارات سبيل المثال للتحقق من تحديد المعلمات ، وبموثوقية الكشف عن جزيء واحد متميز رشقات نارية الفلورسنت. تحليل الصحافة لأداء جزيء واحد الميكون الميكونية تخيل التحليل مع المعلمات تحديد الأمثل. وبعد ذلك، تقديم كل جزيء واحد كما غاوسي 2D الذي يتم ترجيح عرضه من قبل الجذر التربيعي المعكوس لعدد الكشف عن الفوتونات.
تقييم جودة البيانات. استخدام نطاقات الإطارات المقيدة لمراقبة توزيعات الجزيء الواحد في حالات ووقت أكثر تحديدًا. وهذا يفسر حركة العضية أثناء الحصول على البيانات.
في هذه الدراسة، قدمنا إعداد العينة الأمثل، والبيانات الحصول على إجراء وتحليل مع جزيء واحد التعريب المجهري باستخدام conjugates BODIPY. لإثبات مثال على سير العمل للحصول على وتحليل بيانات المجهر توطين جزيء واحد، تم استخدام BODIPY في الخميرة لحل قطرات الدهون تحت حد الحيود البصري. وترد هنا أمثلة على مختلف أنماط التصوير متعدد الألوان من BODIPY في الاقتران مع تحقيقات أخرى مثل GFP و mEos2.
تشكلت "بوديبي-سي 12" في مجموعات متنقلة غير دهنية في محيط الخلية عند الصيام، على عكس دمجها في قطرات الدهون في ظل ظروف تغذية. لزيادة توسيع قدرة المجهر توطين جزيء واحد من conjugates BODIPY لخلايا الثدييات، تم تصويرها BODIPY-C12 و Lysotracker الأخضر في الخلايا U2OS الحية. تحسين تركيز BODIPY وكذلك مثيرة القوى الليزر هي خطوات حاسمة من أجل تصور إشارات جزيء واحد مشرق، وإعادة بناء صور فائقة الدقة.
ويمكن استخدام هذه الطريقة مع أي مترافق بوديبي الأخرى للحصول على رؤية عالية الدقة، في التوزيع الزمني الخاص من جزيئات حيوية محددة داخل الخلايا الحية. مهدت لدينا technic الطريق، لمزيد من استجواب قطرات الدهون والأحماض الدهنية البيولوجيا على مقياس عدسة نانوسكوبية. ومع ذلك ، فإن هذا التطبيق يتجاوز بكثير philopectetes محددة بسبب توافر مختلف conjugates BODIPY الوظيفية.
يرجى التأكد من اتباع إجراءات التشغيل القياسية للتعامل مع العينات والأصباغ البيولوجية، وأيضا أن تكون لدينا التحوطات ملزمة واتباع إجراءات السلامة الليزر.
