Nuestro protocolo describe el uso de tintes BODIPY convencionales para microscopía de superresor resolución utilizando sus estados dispersos y de cambio en rojo. Esto nos permite estudiar orgánulos y biomoléculas en células vivas con resolución de 30 nanómetros. La ventaja de este método es su simplicidad y la versatilidad de los diferentes conjugados BODIPY disponibles que proporcionan una fuente duradera de señales de molécula única.
Nuestra aplicación demostrada podría llegar a ser importante para obtener información sobre enfermedades como la enfermedad del hígado graso o la diabetes tipo 2 mediante la resolución de gotas de lípidos y ácidos grasos por debajo del límite de difracción. Obtenemos información sobre la biología de ácidos grasos y gotas de lípidos en células de levadura y mamíferos. Sin embargo, esta técnica es aplicable a todos los demás tipos de celdas transparentes con fluorescencia de fondo baja.
Cuando utilice la técnica por primera vez, asegúrese de optimizar las concentraciones de di y las potencias láser, para observar señales brillantes de molécula única. Una demostración visual de esta técnica es importante para ver cómo la concentración de di y la optimización de la potencia del láser resulta en señales brillantes de molécula única. Mantener las células U2OS de mamíferos en DMBM no fluorescente con 10%suero bovino fetal de cuatro glutamina milimolares, un piruvato de sodio mililitrolar y un porcentaje de antibióticos de estreptomicina de penicilina en un matraz T-25.
Divida las celdas en 70 a 80% de confluencia a uno a cinco, y pipetee en un solo pozo de una placa de ocho pozos. Altere las células en la placa de ocho pozos durante 12 a 24 horas. Diez minutos antes de tomarlo por imágenes, añadir un Lysotracker verde BODIPY-C12 o y el otro conjugado BODIPY, añadir una concentración final de 100 nanomolares.
Monte los conjuntos de filtros apropiados en la ruta de emisión en función del color de emisión de BODIPY que se esté utilizando. Encienda el microscopio. Etapa del microscopio, láseres de 488 nanómetros y 561 nanómetros, así como la cámara.
Añadir una gota de aceite emergente en el objetivo del microscopio. Abra el software HAL4000 que controla la luz LED para obtener imágenes de campo brillante, potencias láser, persianas láser y ajustes de cámara para imágenes. Establezca la ganancia de EMCCD en 30 y la temperatura de la cámara en menos 68 grados centígrados.
Prepare la cámara y el software correspondiente para grabar películas a 20 Hertz. Encienda el calentador de etapa del microscopio y establézcalo en una temperatura de 37 grados centígrados y a un nivel de dióxido de carbono del cinco por ciento. Ajuste el color de corrección objetivo en consecuencia.
Monte la muestra en la etapa del microscopio y concéntrese hasta que el sistema de enfoque se enganche. Mueva el escenario con el controlador de etapa hasta que aparezcan celdas sanas en el campo de visión. Cargar secuencias de obturación láser para la excitación de monumus así como dimmers, a quienes se detectan poros de fluorescencia de molécula única en el canal de emisión de cambio rojo.
Ajuste la potencia del láser entre el punto 035 y el punto 07 vatios por centímetro cuadrado para el láser de 488 nanómetros, de modo que la fluorescencia convencional aparezca en el canal de emisión verde. Elija una carpeta de destino para películas y grabe de 5000 a 20000 marcos de adquisición para recopilar suficientes localizaciones para reconstruir imágenes de super resolución. Muévase a diferentes campos de visión y repita para recopilar datos para más celdas.
Cargue la película en un software de análisis de microscopía de localización de molécula única. Visualmente visualmente la película y ajuste los ajustes de contraste, de modo que el parpadeo fluorescente de una sola molécula sea visible. Establecer parámetros de identificación de molécula única para el montaje de los PSF gaussianos 2D.
Visualmente a través de algunos marcos de ejemplo para comprobar los parámetros de identificación, y detectar de forma fiable las distintas ráfagas fluorescentes de molécula única. Análisis de prensa para realizar una microscopía de localización de molécula única imagine el análisis con los parámetros de identificación optimizados. Y luego, renderizar cada molécula como un gaussiano 2D cuya anchura está ponderada por la raíz cuadrada inversa del número detectado de fotones.
Evaluar la calidad de los datos. Utilice rangos de trama restringidos para observar distribuciones de moléculas individuales en instancias y tiempo más específicos. Esto explica el movimiento del organel durante la adquisición de datos.
En este estudio, presentamos un procedimiento optimizado de preparación, adquisición y análisis de muestras con microscopía de localización de molécula única utilizando conjugados BODIPY. Para demostrar un ejemplo del flujo de trabajo para adquirir y analizar datos de microscopía de localización de moléculas únicas, BODIPY en levadura se empleó para resolver gotas de lípidos por debajo del límite de difracción óptica. Aquí se muestran ejemplos de los diferentes modos de imagen multicolor de BODIPY en conjugación con otras sondas como GFP y mEos2.
BODIPY-C12 formado en racimos móviles de gotas no lipídicas en la periferia celular en ayunas, en contraste con su incorporación en gotas de lípidos en condiciones de alimentación. Para ampliar aún más la capacidad de microscopía de localización de molécula única de los conjugados BODIPY a las células de mamíferos, se tomaron imágenes de BODIPY-C12 y Lysotracker verdes en células U2OS vivas. La optimización de la concentración de BODIPY, así como la excitación de las potencias láser son pasos críticos con el fin de visualizar señales brillantes de molécula única, y para reconstruir imágenes de super resolución.
Este método se puede utilizar con cualquier otro conjugado BODIPY para obtener información de alta resolución, en la distribución temporal especial de biomoléculas específicas dentro de las células vivas. Nuestra técnica allanó el camino.para seguir interrogando la gota de lípidos y la biología de los ácidos grasos en la escala de lentes nanoscópicas. Sin embargo, esta aplicación va mucho más allá de los filopectetos específicos debido a la disponibilidad de varios conjugados funcionales BODIPY.
Por favor, asegúrese de seguir los procedimientos de operación estándar para el manejo de las muestras biológicas y tintes, y también ser nuestros coberturas obligadas y seguir los procedimientos de seguridad láser.
